Amplification sélective in vitro : PCR

Amplification sélective in vitro : PCR

1. Principe de la technique

Utilisée si on connait la séquence que l'on veut amplifier.

On met ce qui est nécessaire à la réaction dans un tube in vitro. Cette technique consiste à mimer ce qui se passe in vivo lors de la réplication (mais x30). On met donc l'ADN, une ARN polymérase, des amorces, des dCTP, dGTP, dTTP, dATP.

On fait passer le tube à différentes températures :

⁃ étape de dénaturation à 90 °C : on sépare les 2 brins de l'ADN que l'on a mis dans le tube.

⁃ étape d'hybridation : la température dépend des amorces que l'on utilise. Elle est normalement comprise entre 50 et 60°C.

⁃ étape d'élongation à 72°C : température idéale pour la TAQ polymérase. L'enzyme réalise l'élongation des amorces grâce aux dXTP.

On a 2 molécules d'ADN au bout d'un cycle. à chaque cycle, on fait une amplification de 2n : l'amplification se fait de façon exponentielle.

Au delà de 35 cycles, on obtient un plateau. Au début, on a une phase de latence. La phase exponentielle se situe donc entre les 2.

1. Les différents composants de la réaction

• la polymérase

⁃ Le fragment de Klenow : 1ère enzyme utilisée

Grande fidélité dans la réplication.

Problème : fonctionne à 37°C. On est obligé de rajouter de l'enzyme à chaque cycle (car l'enzyme meurt à 90°C). On passe d'une température optimale d'hybridation à une température inférieure (pour que l'enzyme puisse fonctionner) : les fragments d'ADN peuvent s'hybrider de façon non spécifique.

⁃ La Taq polymérase : isolée d'une bactérie thermophile

Résiste à la dénaturation thermique à 96°C.

Hybridation plus spécifique à la température d'activité de la Taq Pol

Grande processivité (15° nts/sec/molécule)

Pas d'activité de relecture exonucléasique (problème)

⁃ La Vent DNA polymérase : extraite de Thermococcus litoralis

Thermostable

Possède une activité de relecture exonucléasique 3'-5'

⁃ La Pwo DNA polymérase : extraite de Pyrococcus Woesei

Thermostable

Possède une activité de relecture exonucléasique 3'-5'

Grande processivité

• L'ADN

Nécessaire en très faible quantité (quelques ng ou même pg). Il est possible d'amplifier des séquences jusqu'à 3000 nucléotides.

• Les amorces

Le plus important dans la PCR (la qualité de la PCR dépend en grande partie du choix des amorces). On a besoin de 2 amorces. Elles délimitent le fragment d'ADN à amplifier.

Calculer Tm (température de fusion : 50% des amorces hybridées). Enlever 5°C pour avoir la température d'hybridation (Th : 100% des amorces hybridées, tout en conservant une spécificité d'hybridation).

Choisir des amorces de 20 à 24 nucléotides.

Les 2 amorces doivent avoir la même température d'hybridation (pas plus de 2°C de différence) : les amorces doivent avoir le même pourcentage de GC.

Il faut éviter que les amorces soient complémentaires sur elles même ou entre elles, pour éviter qu'elles fassent des complexes (sinon on réalise l'amplification des amorces).

Il faut aussi éviter qu'une amorce fasse une boucle côté 3'.

Les amorces doivent avoir une composition en bases mélangées (pas de suite d'un même nucléotide comme TTTGGGAA).

L'extrémité 3' des amorces est importante : les 5 derniers nucléotides ne doivent pas contenir plus de 2 G ou C.

En résumé :

⁃ 20-24 mers

⁃ distribution au hasard des bases

⁃ Tm

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