La chromatographie échangeuse

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La chromatographie échangeuse de cations est une méthode de purification basée sur la séparation des molécules selon leur charge globale. La colonne est constituée d’une matrice sur laquelle sont greffés des groupements ionisables chargés négativement (groupements sulfopropyl, carboxy méthyl, phossphorique, sulfonique) au pH du tampon. Cette matrice sera donc capable de retenir des molécules chargées positivement (cations). Dans le cas des protéines elles seront chargées positivement si leur pHi est supérieur au pH du tampon. Les protéines chargées positivement seront retenues sur la colonne alors que les protéines neutres ou chargées négativement ne seront pas retenues et seront éluées en premier. Pour éluer les molécules positives retenues sur la colonne, il faut appliquer un gradient de force ionique (NaCl par exemple) ou l’ion Na+ jouera le rôle d’un compétiteur. On peut aussi utiliser un gradient de pH croissant.

L’électrophorèse est une méthode de séparation des molécules sous l’effet d’un champ électrique. Dans le cas des protéines, l’électrophorèse est réalisée sur un gel de polyacrylamide constitué d’un réseau de maille plus ou moins large dans lequel les plus grosses molécules sont freinées par rapport au plus petites. La séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dépend donc de la charge et de la taille des protéines. En conditions dénaturantes, on utilise du -mercaptoéthanol ou du dithiothreitol (DTT) qui permet la coupure des ponts disulfures et du sodium dodecyl sulfate (SDS) qui entoure les protéines de charges négatives. En condition dénaturantes, les protéines chargées négativement se déplaceront toutes vers l’anode et leur séparation sur le gel dépendra uniquement de leur taille.

La spectrophotométrie est une technique qui permet de mesurer la capacité d’une solution à absorber la lumière.

Le dosage des protéines par la méthode de Lowry est une technique de colorométrie qui permet de déterminer les quantités de protéines. Pour cela, on mesure l’absorbance à 710nm d’une solution composée de réactif de FOLIN et un réactif sensible aux liaisons peptidiques (liaisons propre aux protéines). Ensuite on fait une gamme de référence avec une solution de protéine de concentration connue, afin de déterminer la concentration en protéine de nos échantillons.

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