La chromatographie liquide haute performance (HPLC)

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)

I) Principe de la chromatographie

La chromatographie est une méthode de séparation des constituants d'un mélange

même très complexe.

Il existe trois principaux types de chromatographie:

• la chromatographie en phase gazeuse

(CPG)

• la chromatographie en phase liquide à

haute performance (HPLC)

• la chromatographie en couche mince

(CCM).

Les deux premières méthodes peuvent être assez largement décrites par des théories

communes. Dans les deux cas, un fluide appelé phase mobile parcourt un tube appelé

colonne. Cette colonne peut contenir des "granulés" poreux (colonne remplie) ou être

recouverte à l'intérieur d'un film mince (colonne capillaire). Dans les deux cas, la

colonne est appelée phase stationnaire. A l'instant initial, le mélange à séparer est

injecté à l'entrée de la colonne où il se dilue dans la phase mobile qui l'entraîne à

travers la colonne.

Si la phase stationnaire a été bien choisie, les constituants du mélange, appelés

généralement les solutés, sont inégalement retenus lors de la traversée de la colonne.

De ce phénomène appelé rétention il résulte que les constituants du mélange injecté se

déplacent tous moins vite que la phase mobile et que leurs vitesses de déplacement

sont différentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après les autres et donc

séparés.

Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur permet d'obtenir

un tracé appelé chromatogramme. En effet, il dirige sur un enregistreur un signal

constant appelé ligne de base en présence du fluide porteur seul ; au passage de

chaque soluté séparé il conduit dans le temps à l'enregistrement d'un pic.

Dans des conditions chromatographiques données, le "temps de rétention" (temps au

bout duquel un composé est élué de la colonne et détecté), caractérise qualitativement

une substance. L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par ces pics et la

prolongation de la ligne de base permet de mesurer la concentration de chaque soluté

dans le mélange injecté.

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II) La chromatographie liquide haute performance

Les organes

a) Un réservoir de solvant (éluant) qui contient la phase mobile en quantité

suffisante. Plusieurs flacons d'éluants (solvants de polarités différentes)

sont disponibles pour pouvoir réaliser des gradients d'élution (mélange de

plusieurs solvants à des concentrations variables) à l'aide de la pompe

doseuse.

b) La pompe : elle est muni d'un système de gradient permettant

d'effectuer une programmation de la nature du solvant. Elle permet de

travailler:

- en mode isocratique, c'est-à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de

l'analyse.

- en mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des

constituants du mélange d'éluants.

Les pompes actuelles ont un débit variable de quelques μl à

plusieurs ml/min.

c) Vanne d'injection : c'est un injecteur à boucles d'échantillonnage. Il

existe des boucles de différents volumes, nous utiliserons une boucle de

20μl. Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la

colonne et de la concentration supposée des produits à analyser. Le système

de la boucle d'injection permet d'avoir un volume injecté constant, ce qui

est important pour l'analyse quantitative.

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d) La colonne

Une colonne est un tube construit dans un matériau le plus possible inerte aux produits

chimiques, souvent en inox ou en verre. Sa section est constante, de diamètre compris

entre 4 et 20 mm pour des longueurs généralement de 15 à 30 crn. Au delà, les

importantes pertes de charges exigeraient des pressions de liquide beaucoup trop

élevées.

e) La phase stationnaire

- La phase normale:

La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut

donc utiliser un éluant apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits

polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaire qui sortent

en tête.

L'inconvénient d'une telle phase, c'est

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