La chromatographie

La chromatographie permet la séparation ou la purification d’un ou de plusieurs composés d’un mélange en vue de leur identification et de leur quantification.

La chromatographie en phase liquide a permis de réaliser des analyses qui n’étaient auparavant pas possible avec les techniques sur couche mince ou en phase gazeuse.

A l’origine la chromatographie en phase liquide se faisait sur des colonnes en verre. Le liquide traversait la phase stationnaire par gravité ou sous faible pression. Puis pour augmenter le débit, des manipulations ont été réalisées sous pression plus forte. C’est ce que l’on a appelér la chromatographie liquide sous haute pression (HPLC). Très rapidement le P de pression est devenu le P de performance lorsque l’on a optimisé la technique (diminution de la taille de particules de la phase stationnaire, régularité de cette phase…).

Principe :

Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne chromatographique.

La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système chromatographique.

Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la phase stationnaire.

En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés par un pic. L’ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme.

2. Notions fondamentales

La phase stationnaire est un support plus ou moins poreux recouvert d’un gel (liquide greffé) qui a les propriétés désirées pour retenir les molécules de solutés.

La phase mobile ou éluant est un liquide qui entraîne les solutés à travers la colonne.

2.1. Notion de temps

t0 est le temps du début de l’injection

Le temps mort tm est le temps mis par un composé non retenu par la phase stationnaire pour traverser la colonne (temps passé dans la phase mobile)

Le temps de rétention tr est le temps mis par un soluté pour traverser la colonne. C’est le temps passé dans la phase stationnaire et dans le volume mort de la colonne. Ce temps est caractéristique d’un soluté dans des conditions d’analyse donnée. La surface du pic est fonction de la quantité du constituant dont il est la trace.

Le temps de rétention réduit t’r est le temps passé par un soluté dans la phase stationnaire, soit :

2.2. Notion de concentration

Le coefficient de partage K :

A un instant donné, le soluté est à la concentration Cm dans la phase mobile et Cs dans la phase stationnaire. Leur rapport à l’équilibre est appelé coefficient de partage K

Ce coefficient est fonction de 3 types d’affinités :

celle entre le soluté et la phase mobile

celle entre le soluté et la phase stationnaire

celle entre les phases mobile et stationnaire

Le facteur de capacité K’ est le rapport de la quantité d’un soluté dans la phase stationnaire et dans la phase mobile.

...