Chromatographie Liquide

Chromatographie en phase liquide,

application en phytochimie

Groupe n°2

Quantité de flavonoïdes (Tebokan® 120) : 23.15 ± 4.84 [mg/comprimé]

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TABLE DES MATIERES

1. BUT DE L’EXPERIENCE 2

2. MATERIEL ET METHODES 2

3. RESULTATS 4

4. DISCUSSION 8

5. CONCLUSION 8

6. BIBLIOGRAPHIE 10

7. ANNEXES 10

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1. BUT DE L’EXPERIENCE

Le but de cette manipulation est de déterminer et vérifier la teneur indiquée en flavonoïdes d’une

phytopréparation à base de Ginkgo biloba L. d’un médicament : Tebokan® 120. Cette plante possède

des vertus vasomotrices qui améliorent la circulation cérébrale. Son principe actif est mal connu et

donc ces effets thérapeutiques sont associés à l’ensemble des flavonoïdes présents dans la plante.

La mesure de la teneur en flavonoïdes est effectuée à l’aide d’une technique analytique fréquemment

utilisée pour ce type d’analyse quantitative : l’HPLC (chromatographie liquide à haute performance).

Cette dernière est une chromatographie en phase inverse c’est-à-dire que sa phase stationnaire est

apolaire (silice greffée avec des C18) et sa phase mobile est plus polaire. Le système est relié à un

détecteur UV à 370 [nm]. Les composés à analyser vont donc migrer en fonction de leur affinité avec

la phase mobile ou la phase stationnaire, mais surtout vont émettre un signal à des longueurs d’onde

spécifiques. Pour les préparations végétales, l’analyse en HPLC se fait généralement en mode

gradient mais pour cette expérience le mode isocratique ne pose aucun problème. Cela signifie que

les proportions de solvant ne diffèrent pas au cours du temps. Pour une HPLC en phase inverse, les

composés très polaire élueront en premier suivi des composés de moins en moins polaires. La

technique HPLC est par conséquent un bon moyen de doser la teneur d’un composé dans un

échantillon selon une droite d’étalonnage faite préalablement avec des échantillons de référence.

Malheureusement les phytopréparations sont composées d’une multitude de molécules. Il faudrait

dans ce cas avoir tous ces composés purs pour pouvoir les doser un à un, mais ceci n’est pas

faisable. Pour simplifier le dosage de flavonoïdes il est possible de procéder à une hydrolyse de

l’extrait pour obtenir au final les aglycones issus des glycosides. Dans le cas du Ginkgo biloba L. seuls

trois aglycones sont présents après hydrolyse : quercétine, le kaempférol et l’isorhamnétine. Pour

cette manipulation, un seul d’entre eux sera concrètement dosé : la quercétine, c’est également le

plus abondant dans la plante. La teneur de l’échantillon pour les deux autres composés sera

déterminée selon un rapport des aires des pics chromatographiques avec celui de la quercétine dosée

auparavant.

2. MATERIEL ET METHODES

Tout d’abord trois comprimés Tebokan® 120 contenant des extraits de Ginkgo biloba L. sont pesés.

Leur masse respective est de : 412.1 [mg], 418.5 [mg] et 416.5 [mg]. Ensuite, ces comprimés sont

broyés ensemble à l’aide d’un mortier et d’un pilon. Malgré un broyage intensif, il reste une sorte de

pellicule faisant parti des excipients du médicament, mais qui sera éliminée plus tard par la filtration.

Pour pouvoir par la suite effectuer une CCM de contrôle (chromatographie sur couche mince : phase

stationnaire : silice), 10.1 [mg] ont été prélevés de la poudre broyée précédemment. La poudre

restante est alors divisée plus ou moins en trois parties égales, soit : 405.9 [mg], 406.0 [mg], 396.0

[mg]. Chacune de ces parties est transvasée dans des ballons de 50 [mL] dans lesquels sont mis 15

[mL] de méthanol et 10 [mL] de HCl 10% pour l’étape d’hydrolyse. Ces mélanges sont ensuite mis

dans un bain à ultrason pendant environs 10 minutes pour dissoudre totalement la poudre. Ils sont

finalement mis à reflux dans un bain marie à 90°C pendant 1 heure sans compter les 10 minutes de

préchauffage de l’appareil. Une fois le reflux terminé, les solutions finales sont filtrées sur papier et

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transférées dans des ballons jaugés de 25 [mL] auxquels sont ajoutés du méthanol jusqu’au trait de

jauge pour compenser les pertes dues au chauffage à reflux. Pour vérifier si l’hydrolyse a bien eu lieu

et est effectivement terminée, une CCM est effectuée avec pour éluant un mélange d’acétate d’éthyle,

d’acide formique, acide acétique glacial et d’eau (100 : 11 : 11 : 26 ; v/v). Un témoin quercétine (1

[mg/mL], solvant MeOH) est utilisé comme référence pour l’analyse CCM.

1 [mL] de méthanol est ajouté aux 10.1 [mg] de poudre prélevés au départ. Après un passage de 10

minutes au bain à ultrasons, la solution est centrifugée

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