Immunologie FACS

Compte-rendu HAV517V FACS

INTRODUCTION 

La cytométrie en flux et tri cellulaire, autrement dit « FACS » (Fluorescence Activated Cell Sorter) est une technique couramment utilisée en immuno-sélections. Les FACS permettent d’analyser quantitativement et qualitativement les cellules en suspension ainsi que de les trier. Sa fonction principale est le phénotypage cellulaire et la purification de population cellulaires. L’avantage de la cytométrie en flux est la collecte rapide de données pour de nombreuses cellules. Elle permet l'analyse et le tri de sous-populations cellulaires complexes.

Le tri consiste à séparer les cellules ou les particules d'un groupe mixte. Ces cellules sont soigneusement retirées de l'échantillon et elles sont ensuite injectées individuellement dans un flux régulier de solution tampon, telle que le PBS. Lors du passage cellulaires (cellules nues ou intactes) à travers d’un laser, la machine mesure toutes les propriétés caractéristiques et optiques. La lumière diffractée mesurée permet d’évaluer la taille (FSC, abscisse) et la granularité (SSC, ordonnée) des cellules. Dans ce contexte, nous allons essayer de caractériser les lymphocytes T généraux et les lymphocytes T helper en mesurant différentes intensité de la fluorescence.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

1.  Préparation des échantillons de cellules spléniques de souris

Les cellules spléniques ont été collectées à partir de rates de souris prélevées maximum 24 heures avant le marquage. La préparation des échantillons a suivi un protocole rigoureux pour garantir l'intégrité des cellules.

1/ Préparation des échantillons cellulaires : Les souris ont été sacrifiées et les rates prélevées ont été broyées pour obtenir une suspension cellulaire. Cette suspension a été filtrée pour éliminer les débris cellulaires indésirables. Puis, les cellules ont été lavées à 1800 rpm pendant 5 minutes à 20°C dans du tampon FACS pour éliminer les impuretés.

2/ Anticorps Utilisés : Pour cette étude de caractérisation des lymphocytes T généraux et des lymphocytes T helper, deux anticorps spécifiques ont été employés : FITC CD4 et APC CD3. Ces anticorps sont spécifiques pour des marqueurs cellulaires, offrant ainsi une identification précise des sous-populations lymphocytaires.

FITC CD4 :

• Fluorochrome : FITC (Fluorescein Isothiocyanate)
• Marqueur cellulaire : CD4, marqueur typique des lymphocytes T auxiliaires (T helper)
• Site de liaison sur l'anticorps : Le FITC est conjugué spécifiquement à l'anticorps ciblant la protéine CD4 présente à la surface des lymphocytes T helper. Lorsque l'anticorps se lie à la protéine CD4, le fluorochrome FITC permet la visualisation et l'identification précise de cette sous-population cellulaire lors de l'analyse par cytométrie en flux.

APC CD3 :

• Fluorochrome : APC (Allophycocyanine)
• Marqueur cellulaire : CD3, marqueur commun à tous les lymphocytes T
• Site de liaison sur l'anticorps : L'APC est couplé spécifiquement à l'anticorps ciblant la protéine CD3, présente à la surface de tous les lymphocytes T. Lorsque l'anticorps se lie à la protéine CD3, le fluorochrome APC facilite la visualisation et l'identification précise de tous les lymphocytes T, permettant notamment de distinguer les lymphocytes T généraux des autres sous-populations.

Ces choix spécifiques d'anticorps et de fluorochromes sont essentiels pour une caractérisation précise des populations cellulaires. Ils offrent une sensibilité et une spécificité élevées, permettant ainsi une identification fiable et une analyse détaillée des lymphocytes T généraux et T helper au sein des échantillons cellulaires spléniques de souris.

3/ Marquage des cellules avec des anticorps spécifiques : Les cellules ont été traitées avec un tampon de marquage (PBS + 10% FCS) pour préparer le marquage et les lavages ultérieurs. Puis, elles ont été divisées en différentes populations et réparties dans des tubes Eppendorf 1,5 ml. Les tubes ont été centrifugés à 1800 rpm pendant 5 minutes à 4°C pour obtenir un culot cellulaire. Dans 100 μl de tampon FACS, les cellules ont été resuspendues. Ensuite, les anticorps fluorescents spécifiques, FITC CD4 et APC CD3, ont été ajoutés à une dilution de 1/50 (50 μl d'anticorps par tube) pour marquer les populations cellulaires de manière sélective. Une incubation d'environ 1 heure à 4°C sous agitation légère a été réalisée pour permettre le marquage spécifique des cellules avec ces anticorps.

4/ Lavage et préparation pour l'analyse par FACS : Les cellules ont été lavées deux fois à 1800 rpm pendant 5 minutes à 4°C dans du tampon FACS pour éliminer l'excès d'anticorps et préparer les cellules pour l'analyse.

1. Analyse par cytométrie en flux (FACS)

L'analyse des échantillons marqués a été effectuée en utilisant un FACScalibur équipé du logiciel Cell Quest.

1/ Configuration des tubes d'analyse : Différents tubes ont été préparés, y compris les cellules non marquées (contrôle négatif), les cellules marquées avec des anticorps spécifiques individuels (FITC CD4 et APC CD3), ainsi que les cellules marquées avec tous les anticorps utilisés (FITC CD4 et APC CD3 combinés).

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