Travaux pratiques Immunologie

                                TP Atelier d’Immunologie

 Introduction :

 Pour étudier les structures et fonctions des protéines recombinantes produites dans Escherichia coli (E.coli) des biologistes ont découverts des protéines fluorescentes nommées GFP (Green Fluorescent Protein) et DsRed ( (Discosoma Red Fluorescent Protein) qu’ils utilisées comme marqueur.Ces protéines ont les incorpores pour mettre en évidence la production de protéine d’intérêt

 La coloration de tissu biologique reste souvent très nécessaire pour l'identification de structure à observer. Certaines colorations sont compatibles avec la vie cellulaire, d'autres nécessitent la fixation des tissus, et parfois nécessite la création de coupes histologiques.

  Les plus utilisé en laboratoire sont les protéines fluorescentes.  La « Green Fluorescent Protein » (GFP) qui fluoresce en vert ainsi que la « Red Fluorescent Protein » (DsRed) qui fluoresce en rouge.

Grace à leur incorporation dans le génome il est possible de d’établir des moyens pour vaincre certaines maladies.

Objectif :

 Durant ce Tp nous allons nous intéresser à un mutant de la protéine DsRed (DsRedT3). Pour cela, nous effectuerons une analyse de cette protéine par électrophorèse sur gel de polyacrylamide après coloration AU BLEU DE Coomassie et par un western blot réalisé à l’aide d’anticorps anti-DsRed après electro-transfert sur membrane de nitrocellulose

Protocoles expérimentaux :

 Nous commençons d’abord par :    

1. Synthèse des protéines :

   Des bactéries contenant les plasmides DsRedT3 ont été mises en culture à 37°C puis sédimentées par centrifugation à 10 000 t/min pendant 5 minutes à 4°C.

  Il y a eu formation de culots bactériens, ces culots bactériens nous les avons resuspendus dans 700 µl de tampon de lyse puis soumis à une impulsion de sonication de 30sec.

  Nous avons ensuite incuber sous agitation pendant 15min à température ambiante, puis soumis une nouvelle fois le mélange à une impulsion de sonication de 30sec et centrifuger à 10 000 rpm pendant 15mins.

 Les surnageants ont été récupérés et nommés extraits bactériens induits(I) et non induits (NI ou contrôle C)

1. Préparation des échantillons

Nous avons en premier temps prélever 500 µl de surnagent du NI et du I

Nous avons dû diluer dans un tampon de charge les 2 fractions collectées durant l’extraction.

Nous avons préparé dans des tubes Eppendorf  

• 50µL de tampon dénaturant(TD) + 50 µL de l’extrait bactérient non induit (contrôle) à partir des 500 µl
• 50µL de TD + 50µL de l’extrait bactérien induit à partir des 500 µl

 Nous avons ensuite fait bouillir ces échantillons pendant 5minutes.

Ces échantillons ont ensuite été déposés sur notre gel dénaturant

Pour cela nous avons déposés :

• Dans le premier gel on a introduit au sein du premier puits 8 µL de solution des protéines de référence non coloré pour le bleu de Coomassie suivi dans le 2ème et 3ème puits 25µL de chaque échantillon dénaturé(NI et I).

Et en laissant un espace d’un puits nous avons ajouté les mêmes composés pour constituer 2 groupes du même gel que l’on sépare ensuite pour chaque binome

• Dans le second gel on a introduit dans le premier puits 5 µl de solution des proteines de référence coloré pour le gel du WB et 25µl de chaque échantillon dénaturé en laissant un espace de puits nous avons également ajouté les mêmes composés pour constitués 2 groupes du même gel que l’on sépare ensuite.

Nous avons ensuite effectué la migration qui a duré 1H environ dans le tampon de migration dénaturant.

L’électrophorèse a été stoppée lorsque le bleu de bromophénol était à 0,5cm du bas du gel.

Pour finir nous avons récupéré le tampon de migration ,démoulé la plaque avec une spatule et orienter notre gel par une encoche par rapport à nos dépôts.

Ensuite, nous avons fait la préparation des gels pour les groupes suivant, pour cela :

•   Un gel de concentration : permet de concentrer le dépôt de solution de protéine (teneur en acrylamide supérieur à celle du gel de concentration)
• Un gel de résolution : permet de séparer les protéines

Les différentes étapes de cette préparation :

Nous avons :

• installer sur le support les plaques de verre
• préparé une solution de gel inférieur à 10% introduit dans l’espace entre les plaques à l’aide d’une pipette pasteur. Le niveau du gel étant supérieur à 2cm du haut de la plaque.
• Avant que le gel ne polymérise nous avons déposé à la surface du gel au pipetman environ 0.2mL d’eau.Le gel polymérise après environ 20min
• Effectuer un mélange pour un gel supérieur à 4% dans un Erlen que nous avons introduit dans l’espace entre les plaques avec une pipette pasteur munie d’une propipette.
• Installer le peigne permettant de former les puits (utilisation de gants.

• Après polymerisation du gel de concentration, on a installé la plaque sur son support et rempli la cuve avec le tampon de migration fourni

Nous avons préparé les gels suivant ce tableau :

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