Travaux Pratiques d’Enzymologie

I) Introduction :

La chymotrypsine est une enzyme protéolytique faisant partie des protéases à sérine. Elle est sécrétée par le pancréas, tout d’abord sous la forme d’un précurseur inactif appelée chymotrypsinogène. Ce zymogène est acheminé vers son organe cible l’intestin grêle où il sera activé sous l’action de la trypsine une autre enzyme protéolytique. Cette dernière clive une liaison entre deux acides aminés transformant le chymotrypsinogène en chymotrypsine π. Puis à la suite de plusieurs réactions d’autolyse on obtiendra la chymotrypsine α.

Le site actif d’une enzyme est composé de deux régions principales le site de fixation et le site de la catalyse. Le site de la catalyse de la chymotrypsine contient trois acides aminés essentiels l’Histidine en position 57, l’Asparagine en position 102 et la Sérine en position 195. Tous trois forment la triade catalytique. Le rôle biologique de cette enzyme est donc de catalyser l’hydrolyse de certaines protéines dans l’intestin grêle.

Durant ce TP nous allons activer le chymotrypsinogène par la trypsine et étudier l’activité de la chymotrypsine avec un substrat spécifique en présence ou en absence d’inhibiteur.

II) Matériels et méthodes :

Matériels résiduels :

Pipettes man : P1000, P200 et P20 et embouts stériles

Pipette Eppendorf de 5 mL

Poire

Vortex

Para film

Formation de la chymotrypsine

Activation du chymotrypsinogène

Dans cette étape nous allons activer le chymotrypsinogène en le mettant en présence de la trypsine puis mesurer l’activité de la réaction en faisant varier le temps de la réaction d’activation.

Matériels :

Un microtube

Une cuve de 30 µL

20 mg de Chymotrypsinogène

2 ml de Tampon d’activation (Tris-HCL 50mM pH 8 NaCl 100 mM, CaCl2 50 mM)

100 µl de trypsine (concentré à 2mg/mL dans le tampon Tris-HCl 50 mM ph 8, NaCl 100 mM, CaCl2 50mM)

2,7 mL de tampon d’activité (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM

300 µL de Bz-Y-pNA à 2 mM (substrat)

30 µL de tampon dénaturant sans DDT : Tampon Tris-HCl 200 mM, pH 8,8 ; EDTA 5mM ; SDS 2% (W/V) ; saccharose 1M ; bleu de bromophénol 0,01% (W/V)

Méthode :

Préparation du mélange d’activation :

Le chymotrypsinogène a été solubilisé dans le tampon d’activation. De cette solution on conservera 30 µL dans un microtube annoté « chymotripsinogène » et on ajoutera les 30µL de tampon dénaturant sans DDT.

Dans une cuve nous avons préparé le tampon d’activité avec le substrat, à ce mélange nous avons ajouté 10 µL de la solution de de chymotrypsinogène. Tout ça dans le but d’effectuer le dosage de l’activité du chymotrypsinogène au spectrophotomètre, cette mesure sera le temps 0 d’activation.

Ensuite nous avons ajouté la trypsine au mélange de chymotrypsinogène dans un rapport trypsine/ chymotrypsinogène représentant 1% en poids et le mélange a été laissé à la température ambiante.

Test d’activité de la chymotrypsine :

Nous suivons l’activation en fonction du temps en mesurant l’activité de la chymotrypsine toutes les 5 minutes grâce au spectrophotomètre.

Pour cela nous avons préparé plusieurs cuves (six) avec le tampon et le substrat. Toutes les 5 minutes environ nous avons prélevé 10 µL du mélange chymotrypsinogène, trypsine et tampon d’activation qui sera mis dans une cuve.

La solution est homogénéisée grâce au para film puis la cuve a été mise dans le spectrophotomètre pour effectuer la mesure d’activité pendant deux minutes. Nous obtenons des mesures toutes les quinze secondes, nous avons pu alors calculer la vitesse de réaction. Sachant que la concentration d’enzyme est proportionnelle à la vitesse de réaction, on considère que le calcul de la pente correspond à la vitesse de réaction de chaque cuve.

Les cuves seront lavées à l’eau distillée entre chaque mesure.

La réaction d’activation sera poursuivi jusqu’à l’obtention une activité chymotrypsine constante c’est-à-dire quand la vitesse de réaction devient stable

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Elimination de la trypsine :

Pour éliminer la trypsine, donc purifier nos protéines nous avons fait une chromatographie d’affinité. Le but ici est de choisir les fractions où la chymotrypsine est plus concentré.

Matériels :

Une colonne contenant un gel de sépharose préalablement activé au bromure de cyanogène et couplé à la p-aminobenzamidine (ligand spécifique de la trypsine active)

Tampon d’élution de la chymotrypsine (Tris HCl 50mM ; pH 8,8 ; KCl 500mM ; CaCl2 20mM)

Tampon d’élution de la trypsine (solution saline acide)

Tubes eppendorf 1,5 mL

microtube

Méthode :

Dès l’obtention d’une activité chymotrypsine stable nous avons versé le mélange d’activation dans la colonne d’affinité.

La chromatographie d’affinité que nous effectuons ici repose sur le fait que la trypsine sera retenue sur le gel de sépharose car celle-ci contient le p-aminobenzamidine qui est un ligand spécifique de cette enzyme. De ce fait la chymotrypsine présent dans le mélange ne sera pas retenue lui et

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