Travaux Pratiques d’Enzymologie

Travaux Pratiques d’Enzymologie :

Etude des propriétés catalytiques de la chymotrypsine

Recommandations - Informations

• Vous devez lire et préparer la séance de Travaux Pratiques.

• Une courte interrogation écrite peut avoir lieu au début de chaque séance de TP.

• A l’issue de chaque séance de TP, vous devrez rendre une fiche de résultats par binôme.

• Chaque binôme fera un compte-rendu à rendre au plus tard 8 jours après avoir effectué les séances de TP.

Prévoir une blouse, un marqueur, une calculatrice et du papier millimétré pour faire les TP.

Introduction

La chymotrypsine est une enzyme protéolytique sécrétée dans l’intestin grêle par le pancréas sous forme d’un précurseur inactif ou zymogène appelé chymotrypsinogène.

Le chymotrypsinogène A de bœuf a été extensivement étudié. Il ne comporte qu’une seule chaîne polypeptidique de 245 aminoacides avec 5 ponts disulfure intrachaînes formés par 10 résidus de cystéine.

Il est activé dans l’intestin par l’action de la trypsine, une autre enzyme protéolytique. La trypsine coupe la liaison Arg 15-Ile16, transformant le chymotrypsinogène en chymotrypsine active. Des réactions d’autolyse par la chymotrypsine ainsi activée aboutissent au détachement de 2 dipeptides en position 14-15 et 147-148 et à la formation de la chymotrysine 

Celle-ci possède donc 3 chaînes polypeptidiques reliées par 2 ponts disulfure, l’un entre les chaînes A et B et l’autre entre les chaînes B et C.

La chymotrypsine est membre d’une importante famille de protéines, les protéases à sérine.

Le rôle biologique de la chymotrypsine est de catalyser l’hydrolyse des protéines dans l’intestin grêle.

La chymotrypsine est une endoprotéase de spécificité non étroite. Elle clive les liaisons peptidiques dont le carbonyle appartient soit à un L-acide aminé aromatique (tyrosine, tryptophane et phénylalanine), soit à un L-acide aminé non aromatique hydrophobe (leucine, alanine…) à condition que sa chaîne latérale ne soit pas trop volumineuse (elle ne reconnaît ni la valine, ni l’isoleucine).

La chymotrypsine hydrolyse aussi les liaisons esters. Bien que sans signification physiologique, l’hydrolyse des liaisons esters est intéressante en raison de son étroite relation avec l’hydrolyse de la liaison peptidique. En fait, la plupart des connaissances acquises sur les mécanismes catalytiques de la chymotrypsine sont issues d’études sur l’hydrolyse d’esters simples :

Trois résidus, dont 2 sur la chaîne B et 1 sur la chaîne C, sont essentiels à l’activité de la chymotrypsine :

His 57, Asp 102 et Ser 195. Bien qu’ils soient très éloignés dans la séquence primaire, ces trois résidus sont très proches les uns des autres dans la structure tridimensionnelle de la molécule enzymatique. Ces résidus, qui forment la triade catalytique, bordent la poche de spécificité de l’enzyme.

Objectif du TP

Au cours de ce TP, vous effectuerez, dans un premier temps, l’activation du chymotrypsinogène par la trypsine et déterminerez les paramètres cinétiques de la chymotrysine active.

Dans une seconde partie, vous étudierez l’effet du pH sur la cinétique enzymatique et déterminerez les pKa d’ionisation des acides aminés impliqués dans la catalyse par cette enzyme.

Activation du chymotrypsinogène

Caractérisation cinétique de la chymotrypsine

I. Activation du chymotrypsinogène

Le chymotrypsinogène est activé en chymotrypsine par la trypsine puis le mélange d’activation est soumis à une chromatographie d’affinité afin d’éliminer la trypsine et de récupérer donc la chymotrypsine active.

Solutions fournies :

- tampon Tris-HCl 50 mM pH 8,0 NaCl 100 mM, CaCl2 50 mM ou Tampon d’activation

- tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,5 NaCl 100 mM ou Tampon d’activité

- tampon Tris-HCl 50mM pH 8,0 KCl 500 mM, CaCl2 20 mM ou Tampon d’élution de la chymotrypsine

- solution HCl 10-2 M, KCl 500 mM ou Solution d’élution de la trypsine

- solution de Bz-Y-pNA 2 mM dans le DMSO (Diméthylsulfoxide) : substrat

- solution de Z-Val-Phe-OH 6 mM dans DMSO : inhibiteur

- trypsine à 2 mg/mL dans le tampon Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 100 mM, CaCl2 50 mM

1) Activation du chymotrypsinogène

1.1 Préparation du mélange d’activation

- Peser 20 mg de chymotrypsinogène à solubiliser dans 2 mL de Tampon d’activation.

Prélever 10 l de la solution pour effectuer un dosage de l’activité chymotrypsine dans les conditions décrites ci-dessous (Temps 0 d’activation).

- Ajouter la trypsine à la solution de chymotrysinogène dans un rapport Trypsine / Chymotrypsinogène = 1 % en poids et laisser à température ambiante.

- Suivre l’activation en fonction du temps en mesurant l’apparition de l’activité chymotrypsique toute les

3 minutes environ selon les conditions décrites ci-dessous (paragraphe 1.2)

- Poursuivre la réaction d’activation jusqu’à l’obtention d’une activité chymotrypsique constante (environ 10 mesures).

1.2 Test d’activité de la chymotrypsine

L’activité de la chymotrypsine est mesurée à l’aide

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