Schéma micro-habitat

TRAVAUX DIRIGES n°1                                                        ESA-IL3

Module TRANSQUA -TECNIQUES D’ANALYSE

Corinne MENANTEAU                                                           Année 2019/2020

Exercice 1 :

On propose d’analyser par HPLC un comprimé contenant de l’aspirine, de la caféine et de la phénacétine. Les conditions opératoires sont les suivantes :

Colonne : Longueur 25 cm, diamètre intérieur 2.6 mm.

     Remplissage ODS avec phase grèffée C18.

Phase mobile : mélange acétonitrile/ eau (30/70), débit : 1 mL par minute

Température colonne : 70° C

Détecteur UV ( réglage à 254 nm)

1. Faire un schéma simple du montage utilisé. 

 Il s’agit d’une chromatographie liquide analytique quantitative (dosage des composés, détermination des pourcentages relatifs) l’objectif de ce dosage étant de vérifier l’adéquation des pourcentages d’une gélule prise au hasard sur la chaîne de fabrication avec ce qui est inscrit sur l’emballage de ce médicament.

[pic 1]

1. On prépare une solution étalon en pesant 200mg de chacun des trois composés dans une fiole jaugée de 100 ml que l’on complète avec du méthanol pur pour analyse. On effectue plusieurs injections de 5 μL de cette solution étalon et l’on mesure l’aire des pics obtenus :

a-Calculer la concentration des composants dans la solution étalon

les concentrations de ces trois composés sont identiques :

          C =  200 mg / 100 mL  = 2 g/L

Remarque : concentrations identiques et pourtant les surfaces de Pics obtenus sont différentes

b-Déterminer le facteur de réponse relative de deux des composants en le normalisant par rapport au troisième.

En général, on prend le pic dont l’aire est la plus importante pour ce calcul

 F a  =  A  phé /  A  asp = 1190 /  238  = 5

 F c  =  A  phé /  A  caf  = 1190 /  660  = 1.8   et     F  phé = 1 (norme)

Concrètement, on peut dire que l’aspirine absorbe 5 fois moins en UV que la phénacétine, et que la caféine absorbe 1.8 fois moins en UV que la phénacétine.

1. On écrase le comprimé dans un mortier et l’on transfert la poudre dans une fiole jaugée de 100 ml que l’on complète avec du méthanol. On injecte alors de 5 μL de cette solution dans les mêmes conditons que la solution étalon et l’on obtient les valeurs suivantes :

Calculer le pourcentage en masse de chaque composé dans ce comprimé.

 On doit donc maintenant calculer les aires corrigées pour chacun des composés

Pour l’aspirine                 A asp x  F asp  = 90 x 5 = 450

Pour la caféine                 A caf x  F caf   = 265  x 1.8  = 477

Pour la phénacétine         A phé x  F asp  =  460  x 1  = 460

  Somme des aires obtenues :    450  + 477 + 460  = 1387

Pourcentages relatifs :  

Pour l’aspirine               % ASP =  ( 450 / 1387 )  x 100  =   32.4 %

Pour la caféine              % CAF  =  ( 477/ 1387 )  x 100  =   34.4 %

Pour la phénacétine         % PHE  =  ( 460/ 1387 )  x 100  =   33.2 [pic 2]

Absorbance en UV                               Phénacétine

[pic 3]

[pic 4]

                                 Aspirine                                                                 caféine

                                                                                temps

Exercice 2 : Chromatographie par échange d’ions

On sépare deux polypeptides A (pHi = 6.2) et B (pHi = 7.8) par chromatographie sur colonne remplie de DEAE-cellulose. On travaille initialement à un pH de 9.8.

 1 mL du mélange est déposé en haut de colonne. On élue avec un tampon de pH de plus en plus faible et on collecte les différentes fractions de l’éluat. On mesure l’absorbance à 280 nm de chaque fraction. On a déterminé par ailleurs que 1 mL du mélange initial dilué 2 fois a une absorbance de 0.600 dans les memes conditions. A et B ont la meme absorbance linéique molaire à 280 nm. Les résultats obtenus sont regroupés dans le tableau ci-dessous :

1. Expliquer les différents temps de l’expérience chromatographique.

Il s’agit d’une chromatographie préparative : on « récupère » les composés après leur séparation (ce type de chromato vous l’avez réalisé en TP de biochimie IL1), c’est une chromatographie par échange d’ions et plus précisément échange d’anions

Les différentes étapes de l’élution :

• Le choix de l’échangeur d’ions et du tampon adéquat
• Remplissage de la colonne
• Dépôt de l’échantillon
• Elution par un gradient de pH
• Recueil et analyse des fractions séparées

 Formule du  DEAE – cellulose   (di ethyl amino éthyl )

       - Cellulose -  N +  ( CH2 CH3 ) 3    

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