Micro Injection Cellule Es

Micro injection cellule es

Pour generer des souris generiquement modififé on injectait dans un ovule fécondé. Moins utilisé car trop imprécis, car le materiel genetique va s’intergeer de facon aleatoire dans le genome par recombinaison non homologue.

C’est quoi unbe cellule ES ? dans le developpement de la souris : structuvre avec cavité : la blastula. On met en culture ces cellules, on va avoir 2 types cellulaires : cellules l’iner cell mass (ICM) et du trophoblaste (TB) : on sépare les cellules car elles sont des capacité d’adhesion et de migration différente. On peut ainsi dérivé des lignées cellulaires ayant les caracteristique des cellules indifférencier : cellule totipotente (cellule souche embryonnaire ), ces cellules peuvent être congélées et modifiées genetiquement.

Mis au point et generation des celules souche a partir de la blastula mais aussi a partir d’un stade ou apaprait l’embryon. Seperation des cellules germinales car comme le but est de transferer les modif genetique d’une generation a une autre : si on est capable de prendre les precurseur de la lignée germinal et de les implanter probleme résolu pour la transmission des caractere geetiquement modififé d’une generation a une autre.

Les cellumes embryonnaire ont des ressemble avec des cellules tumorales, l’inverse etant valable. Une cellule tumorale peut ressembler a une cellule embryonnaire.

Seul les cellules ES on permit de generer des animaux genetiquement modifié, contrairement au cellule EC et EG.

Schema : transgenese par micro injection d’œuf

Au départ 2 souris que l’on a croisé, on recupére à partir des femelles fécondées des embryons au stade blastula ; On genere des cellules ES à partir de ce stade. Ces cellules Es vont pouvoir etre modifier genetiquement : modification du programme genetique au niveau de l’ADN. Ces cellules ES vont etre micro injecté dans une blastula normal. (On peut utiliser des souris blanche ou noire).

On transffere cette blastula dans une mère porteuse pseudogestante. On donne naissance à des animaux qui vont être constitué de cellule blanche et noir : chimère. Une partie des cellules proviennent du receveur foncé noir ou bien des cellules ES modifiée blanche : souris frabriqué a partir de deux types de cellules ES.

On doit pour transmetre le caractere modifié, la modififacation genetique doit etre transmise dans les gonades. Danq les chimeres les gonades sont genetiquements modifiés et d’autres non : trie à faire pour selectionner lesbonnes. Pour cela on croise les chimères avec une souris blanche sauvage et on genere une deuxieme generation qui va etre soit noire soit blanche.

SI la souris est noire ca veut dire que le caractere coloré qui est dominant, l souris a été generé à partir d’ovocyte blanc normaux sauvage et des spermatozoide noir : cette souris possede le locus homozygote sauvage.

Si la souris est blanche : spermatozoide blanc sauvage et d’ovocyte blanc : donc des cellules genetiquement modifié mais hétérozygote.

Puis on croise 2 souris hétérozygote entre elle : ¼ homozygote ; ¼ sauvage et ½ heterozygote.

(les cellules ES portant la modification sont blanches et on croise avec des souris noires (sauvage) et on joue sur le caractère dominant noir par rapport à blanc. Donc dans les chimères une partie des cellules proviennent des cellules noirs de la blastula non modifié et des cellules ES blanche modifiée)

Comment repérer la mutation ? PCR

On a un locus on a inséré une séquence étrangère : transgène. On connait la séquence, on fait des amorces pour amplifier le locus sauvage ou le locus modifié.

Si on a un locus sauvage on va amplfier une bande de taille donnée, si on amplifie le locus sauvage avec des amorces spécifique au locus modifié : rien du tout, sur le locus modifié on aura une bande de taille précise.

Si on a un homozygote sauvge sauvge : on aura jamais rien avec le couple de primer pour la mutation

SI on a un homozygote sauvage : on aura jamais rien avec le couple de primer pour la saouche sauvage

Si on a un hétérozygote ; on aura toute le temps quelque chose quelque soit le type de primer.

Les stratégies d’expression ciblée

Stratégie de selection ou repérage : ici dans la séquence verte on insert un gene codant pour un facteur de resistance à une drogue (G418, Neomycine), les cellules portant ceettes resistance vont pouvoir resister.

On realité on cible le site d’inseerttion en aval d’un promoteur actif (exemple promteur de l’actine actif dans les cellules ES) ce promoteur gouverne toutes les actions nottement celle du truc de resistance.

90% du genome ne code pas : pas actif transcriptionnellement, la plus part du temps les insertion non homologue vont aboutir a une insertion du gene de resistance dans des endroits qui ne sont pas exprimées : cellules non resistante.

Cependant, par recombinaisnon non homologue on peut avoir expression du gene de non resistance.

Pour agmenter la stringeance du syteme de crible on met un deuxieme système : gene avec sequence de resistance mais en plus un gene codant pour la thymidine kinase pour mettre en place un système de selection neagtif.

Comme pour URA3 avec la levure et l’acide fluoroorotique (les levures URA3+ sont incapables de ce difivisé en presence d’acide fluooro) ici c’est la meme chose avec les cellules, la thymidine kinase quand on met des cellules en presence de gencyclovire vont creuver.

On utilise des cellules ES thymidine kinase negative :

Dans le cas de la recombianison homlogue : les deux sites de recombianisons vont aboutir au fait que la sequence tyrosine kinase ne va pas etre incoporé : donc thymine negative et G418 resistance : on a des cellules capable de pousser en presence de gencylovir et de G418.

Dans le cas de lre combansnon non homologue : on va avoir des clones TK+ G418 resistance : clone generé a partir de recombinaison au hasard et non homlogue.

L’efficacité du système de selection est fortement augmenté

En terme de ciblage on peut vouloir cibler l’expression du caractere modifié en fonction du temps. Dans la sequence que l’on insert on peut avoir un gene fonctionnelle (promoteur toussa) on peut faire exprimer le caractere

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