ELECTROPHORESE DE PROTEINES, ELECTROTRANSFERT ET IMMUNOREVELATION.

Compte rendu - TP : electrophorèse

But

L’objectif de ce TP est de contrôler la pureté des fractions obtenues lors du TP lysozyme, par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et western-blot. Les migrations seront révélées par coloration aspécifique au rouge ponceau ou bleu de Coomassie, ainsi que spécifiquement aux anticorps.

Principe

Electrophorèse

L’électrophorèse est une technique analytique d’identification de composés purs. Elle permet de séparer les molécules chargées sur un support poreux soumis à un champ électrique selon leur masse et leur taille.

Ainsi dans ce champ électrique généré par un courant continu les espèces anioniques (-) migrent vers l’anode (+) et les espèces cationiques (+) migrent vers la cathode (-).

Les échantillons sont dénaturés par chauffage en présence de sodium dodecyl sulfate ou SDS, un détergent anionique fort, qui permet de linéariser les protéines et de leur conférer une charge négative. Le β-mercaptoéthanol est un agent réducteur qui casse les ponts disulfures. Ainsi les protéines perdent leur structure tridimensionnelle native, et n'ont plus de pont disulfure, elles sont sous une forme monomérique.

Ici, l’électrophorèse est réalisée dans un tampon tris-HCL à pH=8,8, en présence de SDS ; les protéines déposées seront donc chargées négativement et migreront vers l’anode.

Les protéines de l'échantillon seront séparées par une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. C'est un gel réticulé, obtenu par polymérisation d'acrylamide et de bis-acrylamide qui forme des chaînes. La réaction de polymérisation est initiée par la formation de radicaux libres par le persulfate d'ammonium et catalysée par le TEMED (N,N,N',N'-tétramethyl-1-,2-diaminométhane). La réticulation forme le maillage ou encore appelé tamis moléculaire, laissant passer les protéines selon leur taille et leur forme. La taille des mailles dépend de la concentration d’acrylamide.

La distance de migration d’une molécule lui est spécifique (dépend de sa taille, forme), ce qui nous permet d’identifier la pureté de nos dépôts, en comparaison à des témoins de poids moléculaire connu.

La membrane sera alors révélée grâce au colorant de bleu de Coomassie brillant R250, (principe détaillé ci-dessous).

Western-blot (ou immunoblot) et révélation aux anticorps

Le western-blot est une technique électrophorétique utilisée dans le but d’identifier une protéine spécifique dans un échantillon en contenant plusieurs.

Le mélange de protéine sera tout d’abord séparé par électrophorèse, puis transféré sur une membrane de nitrocellulose (électrotransfert). Ainsi les protéines gardent globalement la même organisation, et sont exposée sur une surface mince. C’est ce qui va permettre de rendre les protéines accessibles aux anticorps.

Après cette étape on réalise une étape de coloration intermédiaire au rouge ponceau (voir principe dans une partie suivante).

Suit ensuite l’étape de blocage. On utilise un détergent (TBS-tween) et une solution diluée de protéines (lait dilué) qui sert à bloquer les sites d’interaction non spécifiques entre la membrane et les anticorps. Les protéines du lait se lient à la membrane dans les sites non occupés par le lysozyme. Ainsi les anticorps ne pourront plus se fixer sur autres sites que celui du lysozyme.

Pour finir la membrane est révélée aux anticorps, qui se fixent sur le lysozyme. Par une réaction enzymatique avec un substrat, le complexe anticorps-lysozyme est rendu visible par une coloration visible à l’œil nu. C’est une coloration spécifique.

Révélation au rouge ponceau ou bleu de Coomassie

Les révélations au rouge ponceau ou au bleu de Coomassie sont des colorations non spécifiques c’est-à-dire qu’elles colorent toutes les protéines. Dans le cadre d’une électrophorèse, elles permettent de mettre en évidence la migration protéique.

Le bleu de Coomassie est utilisé pour les gels car il pénètre facilement dans les mailles, et fixe les protéines. Le rouge ponceau est utilisé pour les membranes, comme la nitrocellulose.

Résultats

[pic 1]Partie 1 : séparation de protéines en fonction de leur masse sur gel de polyacrylamide en milieu dénaturant

Les échantillons en rouge n’ont pas étés traités au β-Mercaptoéthanol, contrairement à ceux en bleu.

• L’ajout de β-Mercaptoéthanol aux échantillons permet de réduire les ponts disulfures participant principalement à la structure tertiaire des protéines, et parfois à la quaternaire. Ainsi la protéine est sous une forme monomérique ce qui permet au SDS de mieux se fixer sur toute la chaîne. La protéine sera déformée, et ce sera le poids moléculaire qui interviendra uniquement dans la migration. Les chaînes ou sous-unités liées par des ponts disulfures seront réduites, et ne participeront plus à la structure de la protéine.

Pour notre électrophorèse, on observe un changement uniquement pour le mélange M. Ce qui s’explique par le fait que certaines protéines possèdent des ponts disulfures participant à leur structure, qui ont étés rompus pour le tube M avec β-Mercaptoéthanol.

En revanche, on n’observe pas de changement pour les migrations de l’ADH dénaturée ou non. On peut donc imaginer que la protéine ne possède pas de pont disulfure. Cependant on observe pour les deux migrations deux bandes, à la même distance, une très faible et une forte. On peut donc penser que l’ADH est formée de deux sous unités, mais qui avaient déjà été séparées par les conditions dénaturantes. Une faible partie de l’ADH n’a pas été dissociée en deux sous-unités ce qui explique la faible bande observée, qui a peu migré. La bande plus importante représente les sous-unités qui migrent plus, étant donné leur poids moléculaire plus faible que l’ADN non dénaturée.

• Afin de déterminer le poids moléculaire apparent de l’ADH, nous avons dans un premier temps répertorié les distances de migration de nos échantillons dans le tableau ci-dessous.

Nous avons pu constater que seuls trois marqueurs sur 6 ont étés retenus dans le gel, les autres sont sortis. Par la suite, nous avons tracé une courbe du pouvoir résolutif du gel. Nous avons associé aux trois migrations un marqueur, en tenant compte de leur poids moléculaire : la phosphorylase B étant le marqueur ayant le moins migré, et l’ovalbumine étant la protéine ayant le plus migré sans sortir du gel, le sérum d’albumine bovine est entre ces deux marqueurs.

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