Le Dosage Des Proteines

Introduction

La méthode de Biuret est une méthode chimique de dosage des protéines

En milieu alcalin, les protéines qui possèdent au moins 4 liaisons peptidiques forment avec les ions cuivre (Cu2+) un complexe bleu-violet. Un dosage colorimétrique est donc possible à 540 nm. Le réactif de coloration utilisé est le réactif de Gornall ; il est composé :

• de sulfate de cuivre, qui donne la coloration bleu du réactif due aux ions cuivre ;

• d'hydroxyde de sodium, qui rend le milieu basique ;

• de tartrate double de sodium et de potassium, qui « chelate » (piège) le ions Cu2+ et évite leur précipitation en milieu basique sous forme d'hydroxyde de cuivre Cu(OH)2 insoluble ;

• d'iodure de potassium, pour éviter la réduction du cuivre.

Un temps de réaction d'environ 30 minutes à l'obscurité est nécessaire à l'obtention d'une coloration stable. La lecture étant spectrophotométrique, il faut cependant réaliser une gamme d'étalonnage ainsi que des témoins de compensations adaptés.

Intérêts

Cette méthode permet d'obtenir un dosage rapide des protéines. Contrairement à la méthode de Kjeldahl (qui reste une méthode de référence légale), les protéines sont dosées sans minéralisation. La technique est donc plus facile à mettre en place et aussi moins onéreuse.

• Le dosage des protéines est envisagé dans le lait, la quantité de protéines est une des qualités permettant de fixer le prix d'achat au producteur

Les autres méthodes de dosage des protéines

Méthode de Lowry

Cette méthode a été développée par Lowry et al (1951) qui ont combiné une réaction au biuret et une réaction au réactif de Folin-Ciocalteu. Ce dernier, à base de phosphomolybdate et de phosphotungstate, réagit avec les tyrosines et les tryptophanes, pour donner une coloration bleue qui s'ajoute à celle du biuret. Cette méthode a été tellement utilisée que l'article original de Lowry est un des articles scientifiques les plus cités au monde ! Encore aujourd'hui on publie de nouvelles vaiantes de cette métode.

La grande sensibilité de la méthode de Lowry est sa principale qualité. Elle peut atteindre 5-10 µg. La zone de linéarité de la réaction est cependant étroite et il faut utiliser la portion linéaire de la courbe qui correspond à l'absorption de l'inconnu.

Cette méthode est très sensible à de très nombreuses substances interférentes: certains peptides et acides aminés. le saccharose, le tris, le glycérol, les dérivés mercaptan, l'EDTA, de nombreux détergents, etc. Des listes exhaustives ont même été dressées à cet effet (Bensadooun,1976; Peterson, 1979). De nombreuses variantes ont été développées pour contrer ces défauts. Entre autres, citons une méthode permettant d'éliminer les substances interférentes par microprécipitation des protéines à l'acide trichloroacétique après complexation avec du déoxycholate (Peterson, 1977).

Méthode uu bleu de Coomassie

Bradford et al (1976) ont développé une méthode basée sur l'adsorption du colorant bleu de Coomassie G250. En milieu méthanolique acide, ce colorant s'adsorbe sur les protéines et cette complexation provoque un transfert de son pic d'adsorption qui passe du rouge au bleu. De nombreuses variantes ont été développées par la suite et on peut se procurer dans le commerce des trousses ("kits") de

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