Cristallisation

1. But

Le but deux molécules présentes dans un même échantillon : le bleu de dextran t la vitamine B12. Cette séparation se fera par chromatographie sur gel d’exclusion G25 et chromatographie d’affinité.

2. Principe

Une façon de séparer les molécules est la chromatographie de perméation, plus souvent appelée chromatographie d'exclusion ("gel exclusion chromatography"), gel filtration ou filtration sur gel ou tamisage moléculaire. On emploie surtout les deux derniers termes quand le solvant est aqueux et que la chromatographie se fait sous pression atmosphérique. Divers fabricants vendent des matrices de filtration sur gel: "Sephadex", "Bio-Gel", ToyoPearl, etc. Il est à remarquer que l'usage le plus courant des résines "Sephadex" est bien la filtration sur gel même si un "Séphadex" peut être utilisé comme colonne d'affinité pour les protéines ayant une affinité pour les dérivés du dextran (glucose).

La grande popularité de cette technique vient du fait qu'elle peut s'appliquer sur une large gamme de masses moléculaires (mais pas toutes !!!). La filtration sur gel sépare les molécules selon leur taille, plus spécifiquement leur rayon de Stokes (Rayon d’une particule sphérique qui aurait le même comportement hydrodynamique que la molécule considérée.). Cependant, puisque la taille d'une molécule d'une catégorie donnée est généralement proportionnelle à sa masse, cette technique est appliquée à la séparation selon la masse. Cependant, il ne faut jamais oublier que les relations entre le rayon de Stokes, la taille et la masse, sont affectées par de nombreux facteurs. La géométrie de la molécule est un des principaux facteurs. En effet une protéine fibrillaire (allongée) et une protéine globulaire de même masse ne se comporteront pas de la même façon dans un gel.

La résine d'un tel gel est constituée de microbilles très poreuses. Le diamètre des pores d'une résine donnée est variable, mais à l'intérieur de certaines limites précises. Certaines molécules seront trop grosses pour entrer dans aucune bille et ne peuvent diffuser qu'à l'extérieur dans le liquide qui les entoure. Elles prendront donc peu de temps pour éluer hors du gel. Au contraire, certaines autres seront suffisamment petites pour diffuser à l'intérieur de toutes les billes en plus de l'espace extérieur. Elles seront retardées et prendront beaucoup plus de temps pour sortir de la colonne. Certaines autres molécules, de taille intermédiaire, pourront entrer dans certains pores de certaines billes. Elles circuleront donc dans une certaine proportion des billes, en plus de l'espace externe. Plus elles seront petites, plus cette proportion sera grande. Elles prendront alors un certain temps (inférieur aux plus petites, mais supérieur aux plus grosses) pour sortir du gel. Ce temps sera donc proportionnel à leur rayon de Stokes, donc indirectement leur taille, donc à leur masse.

Il existe plusieurs types de résine ayant des domaines de fractionnement différents selon les besoins qu'on a. Chaque colonne faite avec une résine donnée a donc des caractéristiques différentes. Le lit du gel dans son entier occupe ce qu'on appelle le volume total du gel (Vt qui comprend le liquide à l'extérieur des billes (Vo, souvent appelé volume mort) et celui des billes (Vs ou volume de la phase stationnaire). Comme les billes sont creuses et constituées de pores, une grande partie de leur volume est rempli de solvant, c'est le volume interne (Vi). Le restant du volume ést celui occupé par les fibres du matériel solide constituant le gel (polyacrylamide, dextran, etc.) et qu'on appelle souvent volume du gel (Vg). Cependant, comme Vg est généralement négligeable par rapport au volume interne. Certains auteurs ne font donc même pas cette distinction et considèrent que Vs Å Vi.

Le volume mort constitue la partie du gel dans lequel peuvent diffuser les molécules de taille supérieure au domaine de fractionnement. Les molécules plus petites que la limite inférieure de fractionnement, peuvent donc circuler aussi bien à l'extérieur qu'à l'intérieur des billes, soit dans Vo + Vi (= Vt - Vg Å Vt). Le volume d'élution (Ve) de chacune des molécules entre les deux limites du domaine de fractionnement sera donc quelque part entre Vo et (Vi + Vo). Les coefficients de partition (Kd) et la fraction de diffusion (Kav) se définissent à partir de ces divers volumes.

Déplacement des molécules dans les diverses parties d'un gel de filtration

Les molécules, dépendant de leur taille, pourront, ou non, entrer et diffuser dans les microbilles de la résine. À gauche: particule trop grosse pour pénétrer dans aucun pore. Au centre: particule suffisamment petite pour diffuser dans certaines billes mais trop grosse pour pénétrer dans d'autres. À droite: particule suffisamment petite pour diffuser dans toute la résine.

Les gels

Le Sephadex™ G, de la compagnie Pharmacia, est probablement la plus connue des résines de filtration sur gel. Il est constitué de dextran (un polymère linéaire de glucose) dont les fibres sont réticulées (En chimie des polymères, la réticulation correspond à la formation d'un ou de plusieurs réseaux tridimensionnels, par voie chimique ou physique) à l'épichlorohydrine (est un composé organochloré) pour former les microbilles poreuses. Les différentes variantes (G-25, G-100, G-200, etc.) sont obtenues en contrôlant la réaction de réticulation. Les variantes ont différentes capacités de rétention d'eau, porosités, domaines de fractionnement, limites d'exclusion, etc. Celles ayant des pores plus grands (G-25, G-50, etc.) ont un domaine de fractionnement très réduit, une limite d'exclusion très basse et un débit rapide. Par exemple, la limite d'exclusion du G-25 est de 5000 Da (L'étalonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimées en Daltons)). Elles sont utilisées surtout pour le dessalage. Celles ayant des pores beaucoup plus petits ont un domaine de fractionnement plus élevé. Ainsi le G-200 a une limite de résolution de 600 000 Da. Comme le dextran est très hydrophile, ce gel est utilisé pour les séparations en milieu aqueux. Les variétés de Sephadex ayant une relativement haute limite de résolution sont cependant très fragiles et ne supportent pas des débits ou des pressions hydrostatiques trop élevées.

APPLICATIONS À LA BIOCHIMIE

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