CR TP Détermination du site actif d’un peptide synthétique par HPLC

TP HPLC : Détermination du site actif d’un peptide synthétique par HPLC

1. BUT

Le but de ce TP est de déterminer la localisation du site d’interaction d’un peptide synthétique avec de l’héparine en utilisant la chromatographie en phase inverse avec appariement d’ions, une HPLC et une chromatographie d’affinité après hydrolyse ménagée par l’α-chymotrypsine.

2. PRINCIPES

Chromatographie en phase inverse (RPC) avec appariement d’ions :

C’est une chromatographie liquide de partage. On l’appelle chromatographie « en phase inverse » car le profil chromatographique (phase stationnaire, phase mobile) est inversé par rapport à la chromatographie en phase normale (NPC).

La séparation des sous unités peptidiques dépendent de l’absorption réversible des molécules selon leur hydrophobicité (polarité). La phase stationnaire est composée de silice polaire sur laquelle sont greffées des chaînes aliphatiques apolaires (hydrocarbures). La nature de la phase mobile est un liquide polaire (eau). Les peptides s’adsorbent par interactions de faible énergie en de nombreux points de la phase stationnaire. L’élution du peptide est réalisée grâce à un gradient linéaire d’acétonitrile qui diminue la polarité du solvant et donc va entrainer une diminution des interactions hydrophobes.

Les composés les plus apolaires sortiront en derniers.

L’appariement d’un ion compensateur dans cette chromatographie permet de minimiser l’effet du caractère ionique de ces peptides sur leur séparation. Il permet de rendre la charge ionique neutre (formation d’une paire d’ion compensateur- ion échantillon) afin de pouvoir séparer les peptides uniquement en fonction de leur polarité. L’ion compensateur utilisé est l’acide Triofluoroacétique (TFA). C’est un acide fort chargé négativement et légèrement hydrophobe. Celui-ci permet de fixer à la fois les peptides très basiques sur les chaînes aliphatiques par interactions hydrophobes et la fixation ionique des peptides chargés positivement à la phase stationnaire.

Chromatographie liquide haute performance (ou pression) (HPLC) :

C’est une méthodologie qui repose sur l’amélioration du pouvoir de séparation des sous unités peptidiques par l’utilisation d’une colonne de haute résolution. Elle permet d’obtenir des temps de rétention réduits. Le principe de séparation est basé sur celui de la RPC avec compensateur d’ions. La colonne est composée de microparticules poreuses de silice, sur laquelle sont greffées des hydrocarbures. Le diamètre des microparticules est homogène et très faible (7 microns).

Conséquence, le solvant (phase mobile) est soumis à une haute pression, fournie par une pompe, afin de pouvoir traverser la colonne car les microparticules tassées ne laissent pas passer le fluide. Après injection du mélange, les sous peptides traversent le système et sont séparés en fonction de leur affinité entre la phase mobile et la phase stationnaire.

Chaque sous peptide est détecté, à 214 nm, à des temps de rétention différents, caractéristiques d’un pic sur le chromatogramme.

Le schéma d’une chaîne d’HPLC en Annexe 1.

3. PROTOCOLE

Afin d’identifier le site d’interaction du peptide avec l’héparine, nous avons réalisé une hydrolyse ménagée du peptide, grâce à l’α-chymotrypsine. Celle-ci nous a permis de rompre la liaison peptidique au niveau de l’acide aminé aromatique, la phénylalanine (F) du côté C-terminal. Nous avons obtenu 2 séquences peptidiques : AVELRSPGISRF et RRKIAKRSIKTLEHKRENAKE.

Pour stopper l’hydrolyse du peptide, nous avons ajouté un inhibiteur des protéases à sérine, le PMSF (phénylméthylsulfonyle-fluoride). Pour s’assurer que l’enzyme ne se réactive pas, on la dénature en augmentant la température et en ajoutant un agent réducteur, le DTT (Didhiothréitol).

Conditions opératoires en HPLC (en RPC):

La colonne :

• Phase stationnaire : apolaire, microparticules de silice greffée (hydrocarbures C8 ou C18) de 7 microns

• Phase mobile : débit constant de 1mL/min

Gradient linéaire d’acétonitrile en TFA 0,1%

Solvant A : TFA 0,1% dans de l’eau (polaire)

Solvant B : Acétonitrile 90%, TFA 0,1%

Programme de gradient :

Etape de fixation : 95% de A, 5% de B

Etape de séparation : (en 12 min) 30% de B, 70% de A

Etape de remise en conditions initiales : (en 2 min) revenir à 5% de B, 95% de A

Détection à 214 nm :

A cette longueur d’onde, nous avons obligation de faire un blanc car nous allons détecter toutes les molécules d’intérêts mais également les impuretés (pics artéfactuels). Nous l’avons choisi car nous pouvons détecter les acides aminés aromatiques et non aromatiques, nous pourrons donc visualiser les 2 pics correspondants aux sous unités du peptide étudié, après hydrolyse, sur le chromatogramme.

Nature et volume de l’injection :

• Injection blanche :

Nature : Tampon NaCl 0,15M, Tris HCl 10mM, pH 7,4

Volume : environ 250 µL

• Injection peptide :

Nature : Tampon NaCl 0,15M, Tris HCl 10Mm, pH 7,4 + peptide à 0,1mg/mL

Volume : environ 250 µL

• Injection peptide digéré :

Nature : NaCl 1M, Tris HCl 10mM (pH 7,4) + une sous unité peptidique.

Volume : environ 350 µL

Le NaCl 0,15M (concentration physiologique) est le tampon dans lequel la sous unité peptide qui possède le site d’interaction va se lier à l’héparine. L’autre sous peptide, ne possédant pas le site d’interaction, va être élué.

Le NaCl 1M est utilisé pour éluer la sous unité peptidique

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