Détermination du site actif d’un peptide synthétique par HPLC

Détermination du site actif d’un peptide synthétique par HPLC

1. But.

L'objectif de ce TP est d'identifier quelle partie d’un peptide connu permet une interaction avec l’héparine, un glycosaminoglycane. Nous allons pour cela effectuer une digestion par l’alpha-chymotrypsine de notre peptide. Les sous peptides seront analysés par HPLC en phase inverse avec appariement d’ion et le fragment d’intérêt sera sélectionné grâce à une chromatographie d’intérêt avec l’héparine.

1. Principes.

a) Chromatographie en phase inverse (RPC):

La Chromatographie est une méthode physico-chimique qui permet la séparation des constituants d’un mélange.

La chromatographie en phase inverse est une chromatographie de partage, c’est-à-dire que la séparation se fait grâce à la répartition des constituants entre les deux phases de la chromatographie. En phase inverse, la phase stationnaire est apolaire et constituée de silice où sont greffés des chaines aliphatiques carbonées. La phase mobile est quant à elle polaire et contient un mélange d’eau et de solvant organique. Cette chromatographie permet donc une séparation grâce à la molarité des molécules à séparer.

Ainsi un soluté très polaire ne sera pas retenu dans la colonne et sera élué très vite grâce à la phase mobile. Au contraire un composé peu polaire sera plus retenu par la colonne par interaction hydrophobe et sera élué moins facilement.

Ici l’élution se fait par gradient grâce à un mélange d’eau, très polaire, et d’acétonitrile (ACN) qui l’est moins afin de diminuer la polarité de la phase mobile. Ainsi on augmente progressivement me pourcentage en acétonitrile afin d’éluer d’abord les composés très polaires puis des composées de moins en moins polaire qui étaient retenus sur la colonne.

L’avantage d’un gradient linéaire est qu’il améliore la résolution des pic en permettant une séparation plus précise des constituants.

On ajoute de l’acide trifluoroacétique (TFA) qui agit comme un ion compensateur et permet donc un appariement d’ion. En effet le caractère ionique des peptides peut interférer avec une bonne séparation (nous voulons utiliser le caractère polaire et non pas ionique pour la séparation). La charge négative du TFA va neutraliser les charges positives des résidus basiques des peptides et créer un élément globalement neutre. De plus en étant légèrement hydrophobe le TFA aide les peptides très basiques à se fixer sur la phase stationnaire par interactions hydrophobes. Il aide aussi à la solubilisation des protéines en solution.

b) High Performance (ou Pression) Liquid Chromatography (HPLC)  

L’HPLC est une méthode de séparation analytique ou préparatoire. Par rapport à une chromatographie classique cette méthode améliore le pouvoir de séparation et réduit le temps de rétention. Elle est donc dite de haute performance.

En effet la granulométrie très fine de la phase stationnaire (7 microns pour ce TP) et sa très grande homogène (en taille et en porosité) permet d'augmenter la surface d'échange entre les molécules et la phase stationnaires.

La pression créée par le pompe permet un débit d'écoulement élevé de la phase mobiles. Cette pression permet à la phase mobile de traverser la phase stationnaire et va diminuer le temps nécessaire pour séparer les composés le long de la phase stationnaire.

La haute pression et le faible diamètre de capillaire (2,1mm) maintiennent le débit constant des molécules au niveau de la colonne.

Ces caractéristiques permettent d’avoir une très bonne résolution et un très grand pouvoir séparateur même avec très peu de quantité de matériel.

Afin de préserver ce système très performant mais fragile, il faut veiller à plusieurs choses dont la pureté des solvants (qui doivent être dégazé) et du l’échantillon que l’on veut séparer.

Les signaux sont détectés dans l’UV par le détecteur.

1. Protocole.

a) Conditions opératoires de HPLC :

- Dimensions colonne : 3cm x 2,1mm.

- Phase stationnaire : silice avec greffage de C8, granulométrie de 7 microns.

-  Débit : 1ml/min.

- Phase mobile : A = H2O + 0.1% TFA ; B = ACN + 0.1% TFA

- Gradient :

- Injection :

• 250µL de solvant (NaCl0.15M, Tris-HCl 10mM ph 7.4) = Injection blanche.
• 250µL du peptide non digéré.
• 150µL de peptide digéré.
• La totalité du peptide récupéré après séparation sur gel d’agarose.

- Absorbance : 214 nm : longueur d’onde d’absorbance de la liaison peptidique. Cependant cette longueur d’onde n’est pas spécifique.

b) Rôle des produits utilisés :

-  α-Chymotrypsine : Enzyme protéolytique à sérine qui va digérer le peptide de préférence après un résidu d’acide aminé aromatique.

- PMSF (Phenylmethylsulfonyl-fluoride) : inhibiteur des protéases à sérine qui va arrêter l'action de α-Chymotrypsine.

- DTT (Dithiothréitol) : agent réducteur qui dénature l'enzyme en coupant ses ponts disulfures.

- TFA (Acide trifluoroacétique) : un acide fort jouant le rôle d’appariteur d’ion.

- Acétonitrile : solvant polaire.  

- Chlorure de Sodium (NaCl) 0,15M : Concentration de NaCL en condition physiologique. Il permet de laver le gel de chromatographie de tout ce qui n’est pas retenu par l’héparine en condition physiologique par l’héparine. Il élimine de plus les interactions électrostatiques afin de ne garder que notre fragment d’intérêt lié à l’héparine.

- NaCL 1M : Permet d’éluer le peptide retenu par l’héparine par effet d’ion compétitif.

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