Etude Du Site Actif Et Des Propriétés Catalytiques De La Chymotrypsine

TP d’enzymologie : Etude du site actif et des propriétés catalytiques de la chymotrypsine

Introduction générale

Le chymotrypsinogène est une enzyme inactive présente dans le suc pancréatique et qui est le précurseur de la chymotrypsine. En effet, c'est sous l'action de la trypsine qu'il va être transformé en chymotrypsine active ou alphachymotrypsine α-chymotrypsine), capable de transformer les protides en polypeptides, puis en acides aminés. La chymotrypsine est également utilisée comme médicament.

Objectif du TP

L’objectif de ce TP est d’activer le chymotrypsinogène en chymotrypsine grâce à la trypsine ainsi que de purifier la chymotrypsine afin de l’analyser par électrophorèse. Il s’agira ensuite d’étudier l’activité de la chymotrypsine en présence d’un substrat spécifique, dans 2 cas : avec et sans inhibiteur.

Principe et protocoles des methodes utilisees

Activation du chymotrypsinogène en chymotrypsine

Préparation du mélange d’activation

Afin d’activer le chymotrypsinogène en chymotrypsine, on prélève 20mg de chymotrypsinogène que l’on place dans 2mL de tampon d’activation. Un aliquot de 30μL de ce mélange sera mis de coté pour l’électrophorèse. De plus, on prélève 10μL afin d’étudier le dosage de l’activité chymotrypsique à T0.

Ce mélange d’activation est ensuite mis en présence de trypsine dans un rapport trypsine/chymotrypsinogène=1% en poids. Or, on a 20mg de chymotrypsinogène et une trypsine de concentration de 2mg/mL. Donc Volume(Trypsine) = 0,2/2= 100μL.

Test d’activité de la chymotrypsine

L’activité chymotrypsique est quantifiée grâce à un substrat spécifique le Bz-Y-pNA dont l’un des produits est le pNA qui absorbe à 410nm.

On va ainsi pouvoir mesurer l’activité spectrophotométrique grâce à l’apparition du produit, prouvant que l’enzyme a bien une activité.

Pour cela on prélève 2,7mL de tampon d’activité que l’on met en présence de 300μL de Bz-Y-pNA, dans 5 cuves, dans lesquelles on ajoute 10μL du mélange d’activation toutes les 5 minutes. On mesure l’absorbance pendant 2 minutes.

Elimination de la trypsine par chromatographie d’affinité

Cette technique est utilisée afin de purifier les protéines.

Elle consiste à déposer 2mL du mélange d’activation contenant la trypsine et la chymotrypsine, dans une colonne contenant le ligand à la trypsine lié à la résine. La trypsine ayant une affinité avec le ligand s’accroche à ce dernier et le reste du mélange (ici la chymotrypsine) passe à travers, mais on élue tout de même la chymotrypsine grâce à 3mL de tampon d’élution.

On régénérera la colonne permettant de détacher la trypsine retenue sur la colonne. Ceci se fait grâce à 5mL de tampon d’élution de la trypsine.

Nous récupérons les fractions d’élution de 1mL de chymotrypsine dans 5 tubes différents, dont on mesurera les absorbances à 280nm afin de quantifier l’activité chymotrypsique sur le Bz-Y-pNA. Les éluâts contenant le plus d’activité chymotrypsique seront poolés.

Analyse de l’activation par électrophorèse SDS-PAGE

L’électrophorèse est une technique permettant de séparer des molécules contenues dans un mélange grâce à un courant électrique. La séparation des molécules se fait par rapport à leur poids moléculaire et à leur charge nette.

Pour ce TP, nous utilisons un agent dénaturant, le SDS, afin de masquer la charge de la protéine. Cela va assurer une migration indépendante de la charge mais seulement de la masse moléculaire de la protéine.

On dépose le gel de séparation mis en présence de catalyseurs, que l’on laisse polymériser sur lequel on ajoute ensuite le gel de concentration mis en présence de catalyseur aussi que sur lequel on place le peigne afin de former les puis. On laisse polymériser et on place le dispositif dans un tampon de migration.

On dépose 20μL dans nos puits nos 4 mélanges :

[1] 15μL de chymotrypsinogène + 15μL de solution tampon DTT (agent dénaturant des ponts disulfure)

[2] 15μL de chymotrypsinogène + 15μL de solution tampon

[3] 15μL de chymotrypsine + 15μL de solution tampon DTT

[4] 15μL de chymotrypsine + 15μL de solution tampon

Le 5ème puits est le marqueur de taille composé de protéines de références :

béta galactosidase

bovine sérum albumine

ovalbumine

lactate déshydrogénase

REse Bsp98I

Beta lactoglobuline

Lysozyme

La migration s’effectue pendant 45 minutes. On colore ensuite les protéines au bleu de Coomassie qui permet l’observation et la visualisation des bandes de protéines dans le gel. Ce colorant a la particularité de réagir avec les acides aminés basiques de la protéine.

On décolore ensuite en rinçant la boite avec un petit volume d’eau.

Détermination des paramètres cinétiques de l’enzyme

On étudie tout d’abord ces paramètres en absence d’inhibiteur.

On se propose de faire varier la concentration en substrat (Bz-Y-pNA) afin d’étudier la cinétique d’hydrolyse du substrat par la chymotrypsine pendant 2 minutes, à 280nm.

Nous devons calculer le volume de chymotrypsine purifiée afin d’avoir 50μg d’enzyme pour chaque essai. On a une concentration C(pool non dilué) = 6,46 mg/mL. On veut 50μg soit 0,05mg dans un volume final de : V(chymotrypsine)= (0,05 ×1)/6,46=7,75 μL.

Ce résultat est inférieur à 10 μL. Ainsi, si on met 10 μL de notre chymotrypsine

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