Biochimie structurale. Détermination du site actif d’un peptide synthétique par HPLC.

Biochimie structurale.

Détermination du site actif d’un peptide synthétique par HPLC.

I. Introduction - But.

Au cours de ce travail pratique, nous utiliserons la chromatographie en phase inversée avec appariement d’ions par HPLC (« High Performance Liquid Chromatography ») afin de déterminer la localisation du site actif d’un peptide synthétique interagissant avec l’héparine. Ce fragment sera isolé et identifié à l’aide de son temps de rétention en HPLC.

II. Principe.

- Principe de la chromatographie en phase inversée avec appariement d’ions :

La chromatographie en phase inversée est une chromatographie en phase liquide où la séparation des molécules s’effectue en fonction de la polarité.

C’est une technique d’analyse quantitative et/ou qualitative des composés.

Les composés sont entrainés par un liquide (phase mobile) et diffusent à travers un solide (phase stationnaire) se trouvant au sein d’une colonne chromatographique. On retrouve donc deux phases distinctes, la phase mobile et la phase stationnaire.

La phase mobile est composée d’un liquide polaire (eau ou alcool) et la phase stationnaire est apolaire (hydrocarbures).

On utilise souvent un gradient d’élution pour la phase mobile au lieu d’un fonctionnement isocratique (afin d’alterner les phases de fixation et de séparation).

La phase stationnaire devient apolaire par une greffe d’une chaine aliphatique en C8 ou C18 sur de la silice. Afin que cela soit possible, la polarité de la phase mobile doit être réduite par ajout d’un composé moins polaire (acétonitrile).

Dans le cas de molécules chargées, on utilise l’appariement d’ions afin de neutraliser le caractère ionique pouvant influer sur la séparation. Il est donc nécessaire d’ajouter un ion compensateur qui va se lier aux ions de l’échantillon afin de former un ensemble neutre. On utilise souvent le TFA (acide trifluoroacétique) car c’est un acide chargée négativement et hydrophobe, il permet donc la fixation des peptides basiques.

Lors de cette chromatographie, les composés les moins polaires seront retenus plus longtemps. Autrement dit, les composés contractant le plus d’interactions hydrophobes avec la phase stationnaire seront d’autant plus retenus.

- Principe de l’HPLC (« High Performance Liquid Chromatography ») :

Le principe reste le même, les molécules se partagent de manière différentielle dans les deux phases. Les molécules vont se répartir entre ces deux milieux. Plus les molécules se partagent dans la phase mobile et plus elles sortiront rapidement de la colonne. On en déduit alors les différents temps de rétention pour identifier les composés.

L’échantillon à analyser entrainé par la phase mobile passe à travers la phase stationnaire de la colonne. On a un débit élevé d’écoulement de la phase mobile, ce qui provoque une augmentation de la pression au sein du système. Cela est nécessaire en raison du tassement des micros particules de la phase stationnaire. On utilise alors des pompes performantes à haute pression (supérieur à 30 bars).

Une autre caractéristique est la faible granulométrie de ces micros particules. Cela permet une meilleure séparation par une augmentation de la surface d’échange. Les pics obtenus graphiquement sont alors plus fins, la résolution est améliorée (le seuil de détection est également plus bas).

L’amélioration de la rapidité de séparation et de la résolution explique le terme « haute performance ».

La chaîne d’HPLC est constituée de différentes parties :

- Le réservoir : Il est constitué des solvants (phase mobile) qui sont reliés à la pompe. Différents solvants sont présents lorsque le système fonctionne avec un gradient d’élution. L’échantillon à injecter est préparé dans un solvant identique à la phase mobile.

- Le système de dégazage : Il permet de lutter contre les bulles d’air qui pourraient abimer la colonne et altérer le système de détection. Un barbotage à l’hélium permet d’éliminer les éventuels gaz dissous.

- La pompe : Elle permet de délivrer un débit continu de la phase mobile. Elle est définie par sa pression maximale (jusqu’à 350 bars), son débit (de 0,01 à 10 mL/min) et la stabilité du flux (< 1%). Elle est souvent contrôlée par un ordinateur. La pompe est reliée à la colonne en position « Load » et à la boucle d’injection jusqu’à la colonne en position « Inject ». La qualité de la pompe est importante pour la délivrance d’un débit constant et précis de solvant (phase mobile).

- Un injecteur : Ce sont souvent des injecteurs en boucle. L’avantage est de pouvoir toujours injecter le même volume de liquide de manière précise. De plus cela permet une injection sans modification de la pression au sein de la colonne. Le volume de la boucle est donc fixe et varie de manière générale entre 5 et 20 uL.

Il est à noter que l’injection de l’échantillon se fait d’abord en position « Load » puis la vanne doit être tournée en position « Inject ». Le volume d’injection doit être inférieur à environ 60% du volume de la colonne vide.

- Une colonne : C’est la partie la plus importante pour la séparation des molécules. La colonne diffère en fonction des composants à séparer (nature, taille). Elle se présente sous la forme d’un tube en acier inoxydable résistant à de très hautes pressions (allant jusqu’à 400 bars). On utilise des colonnes de gros diamètre pour la séparation de substances pures. Dans ce travail pratique, on utilise aussi une pré-colonne afin de la protéger.

- Le détecteur : Il permet d’obtenir un signal qui est enregistré en fonction du temps. Le plus utilisé est un spectrophotomètre d’absorption dans le domaine des UV jusqu’au domaine du visible (190 à 600 nm) qui est relié à la sortie de colonne.

La détection s’effectue donc par

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