Analyses microbiologiques du lait par double inclusion

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TP SAE 1.1 : Analyses microbiologiques du lait par double inclusion

L’objectif de ce tp est de savoir analyser un lait sur des critères microbiologiques par la méthode de double inclusion. On doit, grâce à nos résultats, pouvoir déterminer la nature de ce lait (UHT, Frais, vieux frais…). Pour cela nous allons utiliser la méthode d’inclusion en double couche et la méthode d’étalement pour vérifier la cohérence des résultats obtenus.

(Total de pages : 10)

Sommaire :

• P n° 2 : Matériel  et réactifs nécessaires
• P n° 3 : Logigramme double couche
• P n° 4 : Protocole de manipulation de l’inclusion double couche et étalement
• P n° 5 :  Logigramme étalement
• P n° 6 : Résultats écrits du TP
• P n° 7 : Résultats bruts autres groupes et interprétation
• P n° 8 : Images finales des boîtes de pétri
• P n° 9 : Fiche d’autoévaluation Jade
• P n° 10 : Fiche d’autoévaluation Clara + Conclusion générale de la SAE

Points critiques :

• S’assurer de rester dans la zone de stérilité
• Précision du volume prélevé pour les dilutions
• Lors du versement du milieu PCA, s'assurer qu’il ne soit pas trop chaud afin de ne pas tuer les bactéries
• Lorsque la 2ème couche est déposée attendre que le tout soit bien sec avant de mettre à l’étuve
• Ne pas laisser à l'étuve + de 75h [pic 1]

[pic 2]

Matériel et réactifs nécessaires :

Matériel :

• Four pour la stérilisation en chaleur sèche ou autoclave pour la stérilisation en chaleur humide,

utilisé conformément à l'ISO 7218.

• Étuve, pouvant être maintenue à une température de (30 ± 1) °C.

• Bain d’eau, pouvant maintenir une température comprise entre 44 °C et 47 °C.

• Boîtes de Pétri, en verre ou en plastique, de 90 mm à 100 mm de diamètre.

• Pipettes graduées à écoulement total, ayant une capacité nominale de 1 ml, avec des graduations de 0,1 ml, ISO 835 [1] classe A, ou pipettes automatiques, ISO 8655-2 [2] , utilisant des embouts stériles.

• Tubes, fioles ou flacons, de capacité appropriée et ne dépassant pas 500 ml ici celles utilisés seront de 10 ml

Réactifs nécessaires :

• 5 grammes de caséine
• 2,5 grammes de levure
• 1,0 gramme de glucose anhydre
• 9 grammes de gélose
• 1 litre d’eau
• Échantillon de lait

[pic 3]

Logigramme non détaillé  de la méthode par inclusion en double couche :

[pic 4][pic 5]

[pic 6]

Ingrédients nécessaires à la fabrication du milieu PCA

5 grammes de caséine

2,5 grammes de levure

1,0 gramme de glucose anhydre

9 grammes de gélose

1 litre d’eau

• Préparation du milieu PCA

Dissoudre, dans de l’eau, les composants ou le milieu complet déshydraté, en chauffant si nécessaire. Mélanger soigneusement et laisser reposer plusieurs minutes. Ajuster le pH (6.4), si nécessaire, de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,0 ± 0,2 à 25 °C. Répartir le milieu dans des tubes, des fioles ou des flacons (6.8) de capacité appropriée. Stériliser pendant 15 min à l’autoclave (6.1) à 121 °C. Si le milieu est utilisé extemporanément, le refroidir dans un bain d’eau (6.3) maintenu entre 44 °C et 47 °C, avant utilisation. Sinon, stocker le milieu dans l’obscurité pendant 3 mois au plus, à une température de (5 ± 3) °C, et dans des conditions qui n’altèrent ni sa composition ni ses propriétés. Avant de commencer l’examen microbiologique, faire fondre complètement le milieu, puis le refroidir entre 44 °C et 47 °C dans un bain d’eau (6.3) avant utilisation.

• Préparations des dilutions

Nous allons réaliser des dilutions allant de 10^-1 à 10^-5. Pour cela nous allons dans des tubes de 10 ml insérer 1 ml d'échantillon (avec pipette graduée de 2 ml ou micropipette 1000 ul) que l’on diluera dans 9 ml de sérum physiologique. Opération que l’on répétera à partir de la dilution précédente.

• Méthode d’inclusion en double couche

Pour chaque dilution  que nous avons réalisée nous allons déposer 1 ml sur des boîtes de pétri vides dans lesquelles nous allons couler une première couche de milieu PCA. Après prise en masse de la première couche nous allons couler une seconde pour sceller la première. Cette seconde couche évite le développement de colonies en surface et permet un  dénombrement plus facile et précis. Mettre les boîtes une fois sèches à l’étuve pendant 72h à 30°

• Méthode d’étalement

Pour cette méthode le milieu PCA sera coulé dans les boîtes et séché  avant d’y déposer notre solution bactérienne pour chaque dilution. Le volume déposé sera de 0.1 ml (utiliser une micropipette à 100 ul). Ensuite il faut procéder à un étalement à l’aide d’un râteau. Mettre les boîtes à l’étuve pendant 72h à 30°

[pic 7]

Logigramme non détaillé de la méthode de  manipulation par étalement

[pic 8]

[pic 9]

[pic 10]

Résultats du TP : (figures p8 résultat classe p7)

Pour l’inclusion 10-1  nos résultats ne sont pas comptables (nombre de colonies observables trop faibles). Nous avons observé un problème de contamination de nos boîtes aux champignons, nous avons conclu à un problème de manipulation, probablement une sortie de la zone stérile.

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