La transgenèse animale

1/Introduction

L’extraction et la purification des acides nucléiques sont les premières étapes dans la plupart des études de biologie moléculaire et dans toutes les techniques d’ADN recombinant. L’objectif des méthodes d’extraction des acides nucléiques dans le cas présent est d’obtenir des acides nucléiques purifiés, en utilisant Dosage d’ADN par spectrophotomètre et Électrophorèse sur un gel d agarose        

2/BUT : L’extraction de l’ADN est réalisée sur un végétal,(l’oignon)  dont les cellules leur ADN est  clair et forme une très belle méduse. La manipulation consiste à récupérer l’ADN contenu au cœur des cellules,  purification de ce ADN on utilisant Dosage d’ADN par spectrophotomètre et Électrophorèse sur un gel d agarose        

3/Matériel et Méthode

a/Matériel

Becher                     micropipette        ph mètre                     [pic 1][pic 2]

Erelnmeyer                                     spatule                    micro onde

Eprouvette                                      mortier + pilon    cuve en quartz

Tube eppendorf ,tube a essai      papier filtre         spectrophotomètre      

Pissette                                             pipette                  Appareil d électrophorèse

b/Méthode

Avant d entame l extraction de l ADN il faut  prépare les solutions que on utilise pour l extraction :

1_Solution de lyse cellulaire

2_Solution d’éthanol 70%(solution de lavage)

3_Solution de conservation

1/ LA PREPARATION DE LA SOLUTION DE LYSE

_1% SDS / EDTA 0.1M/ NACL 0.15M

Pour la préparation d’une solution de Volume= 50ml

SDS        EDTA

1% SDS = 1g SDS         100ml       m=PM*V*C[pic 3][pic 4]

        X        50ML        m=372.23g/mol*(50* 0.001)L*0.1mol[pic 5]

X=50ml*1g/100ml=0.5g SDS                  M=1.86g

Na Cl

m=PM*V*C

m=58.44g/mol*(50*0.001)L*0.15mol

m=0.44g

_a l’aide d’une Spatule et une Balance en mesuré les 3 masse et en le met dans un Bécher, avec une Eprouvette en mesuré 50ml d’eau distillé et en le rajoute dans le Bécher finalement en homogénéise  la solution avec un agitateur magnétique

2/ LA PREPARATION DE LA SOLUTION D’ETHANOL  70%(SOLUTION DE LAVAGE )

Ci*Vi=Cf*Vf

Vi=Cf*Vf/Ci=70*50/96

Vi=36.4ml

En messure36.4 ml d’éthanol 96% on utilisant une Eprouvette et rajoute d’eau distillé jusqu’ au  le volume sa sera 50ml

3/ LA PREPARATION DE LA SOLUTION DE CONSERVATION

La masse du  TRIS HCL  = PM*V*C

                                                  = 121.4g/mol*(50*0.001)L*(10*0.001)mol

                                                  =0.006g

La masse EDTA= PM*V*C

                                 =372.23g/mol*(50*0.001)L*0.001 mol

                                 =0.018g

TE= 10/1[pic 6][pic 7]

        EDTA 1ml

Tris HCL 10ml

_En mesuré les 2 masse utilisant une spatule et une Balance et en le met dans un Bécher. Avec une éprouvette en mesuré que un petit volume d’eau distillé  20 ml et en homogène la solution avec un agitateur magnétique. En passe après au calibrage avec un ph mètre en essai d obtenir un ph=8 en utilisant une basse NaOH pour augmenter le ph ou un acide HCl pour diminuer le ph et finalement quand on obtient une solution ph=8 en utilisant une Eprouvette et en rajoute d’eau distillé jusque volume =50ml

Et a l’afin en met les solutions 1et 3 dans un autoclave et pour la solution 2(éthanol 70%)et déjà stérile

4/Mode opératoire

_1/D’abord en commence par découper l’oignon a des petits morceaux de 0.5a 1cm (pour que la solution de lyse contact avec le maximum des cellules  

2/Après en passe a la lyse des cellules (la lyse des cellules végétal est complique car en passe par 3 lyse)

a/LYSE CHIMIQUE

En commence par une lyse chimique .en  met les petits morceaux d’oignon dans la solution de lyse contenant :

SDS : détergent réagit sur les protéines 

NaCl : Cette solution permet d’inactiver des enzymes cellulaires qui pourraient dégrader l’ADN que l’on cherche à extraire.

EDTA : chélateur des ions Mg2+(Mg2+= Co facteur d’ADN ase)

b/LYSE PHYSIQUE (choque thermique)

Apres en passe a la lyse physique par  Incubation de la solution de lyse contenant les morceaux d’oignon dans un bain marie a 60° (température optimal d’action du SDS) pendant 15min puis on le met dans le congélateur a 15°pendant 15min

c/LYSE MECANIQUE

En sort la solution de congélateur et en le mètre dans un mortier  et avec un pilon on  homogénéise  la solution

_ Après en met la solution dans un Erlenmeyer il reste un peux de solution dans le pilon en le rince avec l’eau distille et on l incube dans Erlenmeyer  puis en met  la solution pour la deuxième  fois dans le congélateur

  3/on élimine les déches cellulaire par un papier filtre et a l’aide d’une éprouvette on mesure  5ml de la solution contenant notre ADN  et en rajoute a cette solution 10ml de l éthanol 100%  (il faux que le volume d éthanol 100%sera le double de volume de solution d ADN) l ADN va se précepte et forme une méduse

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