La lactate déshydrogénase : purification partielle par chromatographie d’affinité

La lactate déshydrogénase : purification partielle par chromatographie d’affinité

Le but de ce TP est de purifier la lactate déshydrogénase (LDH) afin d’obtenir une protéine pure à partir d’un échantillon tissulaire de foie de rat contenant toutes les protéines solubles. La méthode utilisée est une chromatographie d’affinité.

La lactate déshydrogénase intervient dans la transformation du lactate en pyruvate :

                                         L-lactate + NAD+                                Pyruvate + NADH + H+

I/ Purification partielle sur gel de bleu de Cibbacron de la LDH contenue dans un extrait          tissulaire

La chromatographie d’affinité utilise  la préférence de la LDH pou le substrat contenu dans le gel d’agarose qui permet de la retenir dans la colonne de chromatographie. Le substrat utilisé est une structure proche du NAD+ mais moins specifique. Puis on fait un lavage de la colonne par l’injection d’un tampon d’équilibration et enfin un lavage du gel qui permet de supprimer toutes les autres protéines que la LDH. Pour récupérer la protéine restée accrochée sur le gel d’agarose, on remplace le tampon d’équilibration par un tampon d’élution qui va permettre à la LDH de créer des liaisons avec le NADH qu’il contient ce qui va l’entrainer hors de la colonne à chromatographie.

Au cours de cette chromatographie on recueille dans des tubes à hémolyse la fraction non retenue par la colonne, puis la fraction de lavage après injection du tampon de lavage. On injecte trois fois 1mL de tampon d’élution et après chaque injection on collecte les éluats obtenus. Cette technique permet d’avoir des tubes contenant de l’extrait de départ (premier tube récolté), un échantillon contenant les protéines autres que la LDH et les trois derniers tubes contenant la LDH en concentration décroissante.

II/ Mesure de l’activité enzymatique de la LDH dans les différentes fractions

Le NADH absorbe la lumière dans le domaine des ultra-violets, à 340nm. On peut donc mesurer l‘activité enzymatique de la lactate déshydrogénase en mesurant la concentration de NADH obtenue après mise en place de la réaction par injection en excès de lactate et de NAD+.

La première mesure d’absorbance se fait avec l’extrait tissulaire (courbe E), le second avec la solution de fin de lavage donc normalement sans la protéine LDH (courbe FE) et les trois dernières mesures se font avec les résultats des élutions successives (E1, E2, E3).

Sur la feuille annexe 1, on trouve les commentaires des tracés.

Le but des calculs suivant va être de calculer les vitesses enzymatiques des différentes élutions, puis de mesurer le rendement et l’enrichissement de notre éluat E1 pour vérifier que la purification effectuée est bien faite.  

Calcul de Δx (min) :

Si 1cm sur la courbe représente 1/6 minute, il faut diviser par 6 les mesures faites

Calcul de Δy en variation d’absorbance :

L’échelle est de 20 cm sur notre papier de mesure qui équivaut à 1 absorbance, donc on divise par 20 notre résultat

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