Clonage moléculaire de l'ADN
Rapport de stage : Clonage moléculaire de l'ADN. Recherche parmi 300 000+ dissertationsPar Shitos13 • 5 Mars 2016 • Rapport de stage • 3 222 Mots (13 Pages) • 1 588 Vues
Clonage moléculaire de l'ADN du bactériophage λ dans la bactérie E.Coli par transformation bactérienne à l'aide du plasmide pBlueScript
LAFFONT François, L1 SV Groupe 4
francois.laffont@etu.univ-amu.fr
Le but de ce TP est d’insérer un gène de résistance à un antibiotique, l’ampicilline, dans des bactéries d’Escherichia coli (E.coli). Pour cela, nous allons procéder à un clonage moléculaire, comportant
plusieurs étapes. |
Le fragment d’ADN situé sur le phage λ est tout d’abord isolé après digestion par deux enzymes de restriction EcoRI et HindIII. Le plasmide, nommé pBlueScript (ou pBS) est lui aussi digéré par ces mêmes enzymes de restriction. Le fragment d’ADN est ensuite inséré dans le plasmide en présence de ligase.
Ce vecteur recombinant, intégrant le gène de résistance est ensuite injecté dans les bactéries E.coli par transformation bactérienne. La méthode du crible blanc-bleu par le réactif X-Gal nous permettra-t-elle de savoir si l’opération de clonage moléculaire a réussi ?
Introduction
|
L'opération consiste à injecter, à l'aide d'un vecteur de clonage, la séquence d'ADN d’intérêt dans un organisme unicellulaire. |
Dans ce cas, l'objectif du chercheur peut être de déterminer la séquence nucléotidique du gène ou de se servir de celui-ci pour doter un organisme de nouvelles capacités métaboliques par production d’une nouvelle protéine. Elle permet donc, une fois la séquence d'ADN identifiée, de faire produire cette dernière à des organismes, comme des bactéries. |
Dans notre TP, le plasmide et l'ADN à recombiner, en l'occurrence l'ADN du phage λ, sont dans un premier temps digérés pour pouvoir ensuite être reliés ensemble à l'aide d'une ADN-ligase. Ces deux fragments d'ADN sont ensuite analysés par électrophorèse.
Enfin, afin de vérifier si l’ADN du phage a correctement été intégré dans l’organisme cible, la bactérie E.coli, nous réalisons un criblage. Grâce à cette méthode, les bactéries ayant censé avoir intégré la molécule d’ADN dans leur organisme, ce que l’on appelle les clones recombinants, seront repérées visuellement.
Les clones obtenus seront ensuite cultivés pour pouvoir les analyser par une seconde électrophorèse.
Matériel et méthodes
Digestion de l'ADN du phage et du plasmide avec des enzymes de restriction : EcoRI et HindIII
On commence par isoler deux types d’ADN : un plasmide bactérien choisi comme vecteur et de l’ADN étranger, en l’occurrence
celui du phage λ. |
Pour réaliser cette étape, nous utilisons des enzymes de restriction. Les enzymes de restriction sont des enzymes de type endonucléases pouvant couper l'ADN double brin au niveau d'une séquence spécifique de quatre à huit paires de nucléotides.
Dans la nature, elles protègent les bactéries contre de l’ADN étranger (ou intrus) provenant d’autres organismes.
La plupart des enzymes de restriction sont spécifiques : elles reconnaissent chacune une séquence nucléotidique cible, souvent palindromique lui étant propre, c’est-à-dire que la séquence nucléotidique est symétrique par rapport à un point central. Ce site est nommé site de restriction. On a identifié et isolé des centaines d’enzymes de restriction différentes.
Les enzymes de restriction coupent les liaisons phosphodiester. Les sites de coupures peuvent laisser des extrémités franches, coupant les deux brins d'ADN au même nucléotide, ou des extrémités cohésives (décalées).
Ici, les enzymes utilisées pour couper l’ADN du phage λ et le plasmide pBlueScript : HindIII et EcoR1 produisent des extrémités cohésives.
EcoRI reconnait la séquence 5’-G/AATTC-3’
HindIII, la séquence 5’-A/AGCTT-3’
Les séquences reconnues par ces deux enzymes sont donc des sites de 6pb.
On peut ainsi estimer que ce site se rencontrera tous les 46 (soit 4096 pb), ce qui génèrera des fragments ayant en moyenne 4,1kb.
Ces protéines sont extraites de bactéries et fonctionnent donc à des conditions optimales, c’est-à-dire à 37 °C et selon une bonne force ionique du milieu.
Les enzymes de restriction sont dans un tampon salin (Tris HCL, MgCl2, NaCl) qui leur permet d’être actives.
Leur nom désigne le genre et l’espèce bactérienne dont elles proviennent et le chiffre romain qui suit désigne
l’ordre de caractérisation des enzymes. |
Par exemple, EcoRI vient d’Escherichia coli et HindIII de Haemophilus parainfluenzae.
Etant donné que la séquence cible se trouve à plusieurs endroits sur la longue molécule d’ADN du phage, l’enzyme coupe celle-ci en de nombreux endroits. Sur le vecteur, le site de reconnaissance reconnu par les enzymes de restriction est seulement au niveau du site multiple de clonage (ou polylinker), ciblant le gène d’intérêt.
Le plasmide comme vecteur de clonage
Les vecteurs sont des molécules d’ADN de petite taille dans lesquels on insère le fragment d’ADN à étudier.
Ces ADN sont généralement issus de virus bactériens (bactériophages) ou de plasmides.
Divers vecteurs existent mais ils sont choisis en fonction de la taille de la séquence à cloner, également nommée insert. Ils présentent dans leur génome les signaux nécessaires à leur réplication, mais sont incapables de réplication autonome. Ils doivent donc être introduits dans des cellules hôtes.
...