Le clonage des molécules d’ADN

Le clonage des molécules d’ADN

Auteur : VACCARELLA Caroline, campus Luminy, Groupe 3.

Résumé : Le but du tp a été le clonage de molécule d’ADN. Pour cela, nous avons digéré l’ADN et le plsm en utilisant des enz res qui les clivent au niveau de séquences spécifiques et visualisé ces fragments pas électrophorèse. Puis, nous avons ligué ces derniers en utilisant une ligase qui lie des fragments d’ADN aux extrémités complémentaires. Nous avons également transformé les bactéries en leur introduisant des plsm contenant l’insert ; leur membrane plasmique devant être déstabilisée, nous avons effectué un choc thermique. Puis nous avons reproduit les bactéries, sélectionné et identifié les clones contenant le plsm par introduction de l’antibiotique dans le milieu et les plsm contenant l’insert par un criblage (méthode blanc-bleu). Après sélection des clones positifs et négatifs, nous avons extrait les plsm de ces clones par utilisation de tampons aux propriétés particulières. Une digestion et une analyse de fragments ont été répétées.

Abréviations : plsm : plasmide ; enz res : enzyme de restriction ; phL : phage lambda ; pB : paires de bases ; ncl : nucléotides.

Introduction : Le clonage moléculaire est une des bases du génie génétique [1]. Il repose sur un ensemble de techniques qui permettent d'isoler et de reproduire des gènes [2]. Le clonage d’un gène consiste à isoler ce gène, l’introduire dans un vecteur et à le reproduire en grand nombre. L’intérêt du clonage est de produire des molécules trop complexes à synthétiser par voie chimique et constitue une alternative plus intéressante au regard d’autres procédés d’obtention de molécules actives. L’ADN (support de l’information génétique) contient de séquences dont le clonage est intéressant. L’ADN que nous avons cloné est celui du phL. Le phL est un virus bactériophage qui infecte la bactérie Escherichia coli. Pour cloner cet ADN, nous avons clivé sa séquence et obtenu des fragments de différentes tailles que

avons insérés dans un vecteur. Le clivage a été effectué par des ens res. Chaque enz res reconnaît ainsi un site spécifique. Les enz res sont des endonucléases bactériennes synthétisées et utilisées par les bactéries pour se protéger des ADN étrangers qui peuvent les agresser. Les enz res utilisées pour ce tp sont EcoR1 et HindIII.

Digestion d’un ADN double brin par EcoR1

TD clonage.ppt-DT-TD_clonage.pdf

Digestion d’un ADN double brin par HindIII

TD clonage.ppt-DT-TD_clonage.pdf

Les fragments obtenus après clivage sont insérés dans un vecteur de clonage qui est capable de réplication autonome dans une cellule hôte donnée qui possède un site multiple de clonage et qui présente un système de sélection (résistance aux antibiotiques). Les vecteurs de clonage peuvent être des organismes procaryotes (multiplication rapide, facile à manipuler, facile à transformer) ou des organismes eucaryotes (processus d’excision-épissage et réalisation de modifications post-transcriptionnelles complexes). Le vecteur utilisé est le plsm pBluesript.

Plasmide

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