Les sources d’ADN pour le clonage

VERSITE D’ABOMEY CALAVI

FACULTATIVE DES SCIENCES ET TECHNIQUES DEPARTEMENT DE LA GENERATIQUE

THÈME

NOM du Prof

AGBANGLA Clément

NOM DE L ’ETUDIANT

HOUNSOU-BO E. Claud

Génie génétique 5

Mme Kilhoffer

1 Les sources d’ADN pour le clonage

LES SOURCES D’ADN POUR LE CLONAGE

Pourquoi cloner de l’ADN ?

- Isolement et propagation de fragments d’ADN purs

- Expression et purification de grandes quantités de protéines

- Séquençage de régions génomiques

- Modifications in vitro de séquences d’ADN.

Obtention de l’ADN qu’on obtient :

- par PCR

- par synthèse chimique d’oligonucléotides suivie d’un assemblage

- à partir de banques d’ADN : banque d’ADN génomique, banque d’ADN complémentaire

I. PCR

Une des méthodes les plus employées. On la fait soit à partir d’ADN génomique, soit à partir d’ADN

complémentaire, soit à partir d’un fragment d’ADN déjà cloné.

1. A partir d’ADN génomique

L’ADN génomique comporte la séquence totale du génome et donc l’ensemble des gènes de

l’espèce.

Les gènes comprennent les exons (séquences codantes) et les introns (séquences non codantes).

L’amplification peut cibler (selon les amorces choisies) :

- la partie codante d’un gène à un seul exon codant

- la séquence complète du gène (avec plusieurs exons et introns)

- des régions régulatrices.

On prend des cellules dont on isole l’ADN, on choisit l’ADN à cloner, on sépare les brins et on ajoute

les amorces, on amplifie par PCR.

Voir schéma

Séquençage et annotation des génomes :

Accès aux séquences codant un gène donné (+ séquences régulatrices en amont)

- Gène codé par un exon connaissance du CDS (entre ATG et STOP) design d’amorces sens et

antisens (PCR à partir d’ADN génomique) amplimères correspondant au segment codant.

- Gène morcelé connaissance du CDS (entre ATG et STOP) synthèse d’amorces sens et antisens

(PCR en utilisant l’ADNc ou à partir de banques d’ADNc) amplimères correspondant au segment

codant.

Voir schéma

http://www.lecomprime.com

Génie génétique 5

Mme Kilhoffer

2 Les sources d’ADN pour le clonage

a) Gène avec un seul exon codant

ADN génomique (cellules sanguines, cellules buccales)

Cas idéal

Voir schéma

Insertion dans un vecteur, expression directe. Addition d’extrémités compatibles avec le vecteur

(dépend du vecteur choisi).

b) Gène avec plusieurs exons codants

Si ADN génomique

Le clonage de cet ADN peut se faire, mais l’expression dans une cellule procaryote ne donnera pas le

message adéquat (dans une cellule eucaryote l’expression pourrait être possible). Plutôt cADN.

Voir schéma

2. A partir d’ADN complémentaire = ADNc

Gène morcelé (transcription, excision/épissage) ARN messager spécifique d’un tissu 

(transcriptase inverse + amorce 1) ADNc simple brin (ADN pol + amorce 2) ADNc double brin

(Taq + amorces 1 et 2) amplification et production de la séquence ad hoc

Extraction ARNm ou fournisseur

Achat de clones cADN chez un fournisseur

3. PCR à partir d’un plasmide portant un fragment d’intérêt (séquence

codante)

Exemple : fragment dans un plasmide de clonage à mettre dans un plasmide d’expression.

Séquence du fragment cloné connue Synthèse d’amorces avec extrémités ad hoc (en vue de

l’insertion dans

...