Biochimie TP

1. Utilisation d’enzyme pour le dosage de substrat en phase homogène

1. Méthode de dosage en point final :

Seulement dosage du substrat, absorbance de t1 et t2 dans la phase stationnaire.

1. Principe général :

S1 + S2 🡪 P1 + P2

On veut doser S1. P2 absorbe a une longueur d’onde comparé à S1, S2 et P1.

Dans la cuve : Tampon + S1 à doser + S2 en excès et à t=0 on ajoute l’enzyme. Et mesure absorbance P2 quand réaction finish (Absorbance atteint valeur max = plateau)

[pic 1][pic 2]

[pic 3]

[pic 4]

[pic 5]

1. Nécessité d’un étalonnage

Etalonnage avec un contrôle. Permet de déterminer [S1]

[S1] = (Abs(ech) * C(et) / Abs(et))

Etalonnage car : Appareillage pas parfait, spectro se dérègle + réaction pas forcément complète.

1. Déplacement artificiel de l’équilibre de la réaction

Rendre réaction totale si ce n’est pas le cas.

S1 + S2 ⬄ P1 + P2 à une température donnée, il existe une KT (constante d’équilibre)

KT = ([P1]eq * [P2]eq)/([S1]eq * [S2]eq)

Pour modif la concentration des produits ou substrats :

• Modif pH (avec tampon)
• Piège chimique du produit
• Piège enzymatique du produit par couplage à une réaction principale à une réaction auxilliaire

VOIR EXEMPLE

1. Réaction indicatrice

Coupler substrat et/ou produit avec des réaction indicatrices si ils ne donnent aucun signal mesurable.

Réaction indicatrice : Réaction complète + réaction principale/auxiliaire

Réaction principale : Réaction où intervient substrat ou enzyme à doser

Réaction auxiliaire : Réaction principale faisant lien entre réaction principale ou indicatrice

VOIR EXEMPLE

1. Avantage et inconvénients

Avantage :         Condition préparatoire pas contrôlé précisément

                Méthode facile

Inconvénient :         €€€
                Longue méthode

                Besoin blanc réactif

1. Méthode de dosage cinétique

Pour dosage du substrat et aussi de l’enzyme

1. Dosage cinétique par détermination d’une vi

Pour dosage d’enzyme saturant en substrat : vi = kcat * [E]totale

Pour dosage de substrat en condition saturante

1. Dosage cinétique par détermination d’une v moyenne
2. Condition à respecter
3. Avantage et inconvénients

1. Utilisation d’enzyme immobilisées

1. Méthode d’immobilisation :

1. Immobilisation par rétention physique

1. Inclusion dans une matrice
2. LE confinement par micro-encapsulation

1. Immobilisation par rétention chimique

1. Absorption ionique sur un support chargé
2. Fixation covalente sur un support
3. Coréticulation

1. Influence de l’immobilisation sur les propriétés enzymatique

1. Hétérogénéité
2. Diminution l’activité enzymatique
3. Augmentation du Km apparent
4. Augmentation de la stabilité thermique
5. Modification du pH optimal apparent

1. Choix de la méthode d’immobilisation et évaluation

1. Choix de la méthode
2. Evaluation

1. Utilisation d’enzyme immobilisées

1. Les différents types de réacteurs enzymatiques

1. Classification

La forme soluble ou immobilisée de l’enzyme

        Avantage : Facilité de récup, grande stabilité

        Inconvénient : Moins de performance, cout

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