Enzymologie

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Université Aix-Marseille                                                                LE 22/11/2021

Faculté des sciences - Luminy

3ème année de licence

Sciences de la vie

Parcours : Biochimie

Unité d’enseignement : Enzymologie

Compte rendu TP Enzymologie  

Fait par :

DOUAR Malek et MATOUGUI Aimen

Groupe : 2A

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1. Introduction :

Une enzyme est une molécule biologique qui intervient dans des réactions biochimiques pour le but de transformer un substrat en produit. Une enzyme est beaucoup plus volumineuse que son substrat, il semble qu’on ait besoin d’une architecture complexe pour permettre aux acides aminés de l’enzyme de se trouver dans l’emplacement nécessaire pour servir de catalyseurs à une réaction. La structure de l’enzyme sera donc déterminante pour sa fonction.

Plusieurs facteurs entreront en ligne de compte pour le bon fonctionnement d’une enzyme. L’activité d’une enzyme croîtra avec la température. Cependant, cela ne sera plus vrai quand la température sera assez élevée pour dénaturer l’enzyme et affecter sa structure tertiaire fonctionnelle.

Le pH aura le même effet. L’état d’ionisation des différents acides aminés d’une protéine aura une grande influence sur sa structure. Il faut aussi considérer l’état d’ionisation des acides aminés du site actif. Les enzymes auront par conséquent des pH optimaux différents, selon leur structure et la nature de leur site actif.[pic 3]

Selon la commission des enzymes EC (Enzyme commission), il existe 6 classes d’enzymes :

EC 1 : Oxydoréductases (catalysent les réactions d’oxydoréduction).

EC 2 : Transférases (transfèrent un groupement fonctionnel, un phosphate par exemple).

EC 3 : Hydrolases (catalysent la coupure de liaisons avec consommation de H2O).

EC 4 : Lyases (catalysent la coupure de liaisons sans consommation de H2O)

EC 5 : Isomérases (catalysent les réactions d’isomérisation dans une molécule)

EC 6 : Ligases (catalysent la formation de liaisons covalentes entre deux molécules).

L’enzyme qui nous intéresse appartient à la classe des Hydrolases. La chymotrypsine est une enzyme digestive qui appartient à la famille des protéases à sérine qui décompose les protéines dans l’intestin grêle. Elle est synthétisée sous forme de molécule plus grosse dans le pancréas et transportée sous une forme inactive « zymogène » ou « Chymotrypsinogène ». Une fois dans l’intestin grêle, Elle est activée par une autre enzyme digestive qui est la trypsine Cette dernière intervient en coupant la liaison Arg15-Ile16 transformant le chymotrypsinogène en chymotrypsine actif.

Le fonctionnement des enzymes est dû à leurs site actif ce dernier intervient grâce à sa spécificité au substrat et aussi l’alignement des groupements réactionnels qui abaisse l’énergie d’activation.

La chymotrypsine est composée de 241 acides aminés dont 3 résidus sont situés dans son site actif qui sont essentiels à son activité enzymatique : His57, Asp102 et Ser195.

1. Objectif du TP :

L’objectif de notre TP est de se familiariser avec une protéase à serine qui est la chymotrypsine pour cela ont à diviser notre travaille en 2 parties

2.1/1ère partie : consisté à l’activation du chymotrypsinogène par la trypsine ce qui nous a permis d’obtenir une chymotrypsine active afin de la purifier et l’analyser par la suite

2.2/2ème partie comprend la séparation par gel de polyacrylamide et la détermination des paramètres cinétiques en présence et en absence d’inhibiteur

1. Les principes des techniques utilisées en TP :    

3.1/Electrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) :

Le gel de polyacrylamide est créé par la polymérisation d’acrylamide et bis-acrylamide, en présence d’agents de

Polymérisation (TEMED, persulfate d’ammonium par exemple). Plus la concentration en acrylamide est élevée, plus les pores seront petits et plus les molécules seront freinées dans le gel.

Comme toute technique électrophorétique, la SDS-PAGE permet la séparation des particules en fonction de leur charge électrique et pour des charges identiques, en fonction de leur taille.

Dans le cas de la SDS-PAGE, la séparation est réalisée en conditions dénaturantes en raison de l’ajout de SDS

(Dodécylsulfate de sodium) qui est un détergent fort possédant une longue queue hydrocarbonée hydrophobe et une extrémité chargée négativement, Il interagit avec les protéines par sa portion hydrocarbonée

En liant leurs régions hydrophobes. En se liant à la protéine, le SDS empêche son repliement et lui confère une charge nette négative.

La structure native de la protéine est donc dénaturée, est une charge apparente négative est alors conférée à la protéine. En présence de SDS, les protéines auront donc toute une charge apparente négative, elles migreront vers toutes vers l’anode. Cela signifie que seul le poids moléculaire des protéines est le facteur de séparation.

Les protéines ayant un petit poids moléculaire, seront moins retenues dans les pores du gel de polyacrylamide et migreront donc plus loin que les grosses.

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3.2/chromatographie d’affinité :

Dans cette technique, un ligand, qui lie spécifiquement la protéine d’intérêt, est fixé de manière covalente à une matrice poreuse et inerte, Quand une solution contenant un mélange de protéines traverse la colonne, la protéine d’intérêt se liera au ligand immobilisé, alors que les autres protéines ne s’y lieront pas et sortiront de la colonne.

 On peut alors récupérer la protéine désirée sous une forme très pure en modifiant les conditions d’élution pour faire en sorte que la protéine se détache du ligand soit en ajoutant un excès de ligand libre dans la colonne celui-ci entre en compétition pour la liaison de la protéine ou en changeant le pH, la force ionique et/ou la température.  

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