Rapport enzymologie

Principe :

Le pH optimal est le pH dans le quel l’enzyme est la plus active,  donc a ce pH l’activité enzymatique est maximale

Pour déterminer le pH optimal de la protéase on va étudier l’activité de l’hydrolyse de la caséine à de différents pH donc on varie le pH du milieu et on mesure l’activité enzymatique via la densité optique pour déterminer le pH adéquat à une hydrolyse optimale.

Tout changement de pH au-dessus ou en dessous de l'Optimum entraînera une diminution de la vitesse de la réaction, puisque plus de molécules enzymatiques auront des sites actifs dont les formes ne sont pas complémentaires à la forme de leur Substrat.

Matériel utilisé :

• Micropipette P 5000
• Micropipette P1000
• Tubes à essais
• Entonnoir
• Becher
• Papier  wattman
• Agitateur vortex
• Bain-marie
• Cuve en verre
• spectrophotomètre
• Eau distillée
• Solution de TCA à 4%
• Solution de Na2CO3 à 0.2% diluée dans du NaOH 0.1 M
• Réactif de Folin-Ciocalteu dilué à 50%
• Tampon phosphate/ citrate 0.2M pH 3,7, 9,11
• Solution de caséine à 2.5 %
• Extrait enzymatique

Mode opératoire :

Préparation du réactif:

• mesurer 500µl de l’extrait enzymatique et rajouter 750 µl de la solution tampon (3,5,7,9,11 chaque pH dans un tube diffèrent tour ) et 1250 µl de la caséine puis agiter et incuber au bain-marie à 50 °C durant 30 minutes ensuite rajouter à la solution  1250 µl de la solution TCA .Laisser reposer 10 minutes à température ambiante
• Filtration :

         Placer le papier wattman dans l’entonnoir, verser la solution.

 Récupérer le filtrat. Prélever 500 µl du filtrat, rajouter 1500 µl de Na2CO3 ensuite 250 µl  de réactif de Folin.

Préparation du blanc (témoin) :

• Prélever 500 µl d’extrait enzymatique à l’aide de la micropipette P1000 et verser dans un tube à essai
• Rajouter  750 µL du tampon phosphate  à pH 3 ou bien 5 ou bien 7 ou bien 11
• Rajouter au mélange 2500 µl du TCA et notamment 1250 µl du substrat
• Agiter et incuber à température ambiante pendant 10 minutes
• Filtrer en récupérant le filtrat dans un nouveau tube
• Prélever 500 µl du filtrat et leur rajouter 1500 µl de Na2CO3 et 250 µl du réactif Folin respectivement.
• Agiter et incuber à l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante
• Après 30 minutes  verser chacune des solutions témoin et réactif dans une cuve
• Lire l’absorption de chaque solution

Résultats et discussion :

On remarque que les résultats obtenue sont faux et ne correspondent pas aux résultats attendus

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