TP, enzymologie.

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Nom : Hezil                                                                                date : 07 déc  2016

Prénom : Islam

Groupe : 07

Section : B

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Introduction :

Principe :

La détermination du pH optimum pour l’enzyme protéase se fait en étudiant la réaction d’hydrolyse de la caséine à différents pH. Pour se faire, on suivra l’activité enzymatique par spectrophotométrie dans différents pH.

Matériels et méthodes :

1-Matériels :

-Tube à essai

-Papier filtre Whatman

-Pipette de 1,2 et 5 ml

-Micropipette P1000

-Spatules

-Cuve en verre

-Spectrophotomètre

-Balance de précision

-Agitateur Vortex

-Bain-marie.

2-Réactifs :

-Solution de TCA (Tri-Chloro-Acétate) à 4%

-Solution de  à 0.2% diluée dans NaOH 0.1N[pic 4]

-Réactif de Folin-Ciocalteau dilué à 50%

-Tampon phosphate/citrate 0.2M, pH 3,5,7,9,11

-Substrat : solution de caséine à 2.5% dans le citrate de Sodium 0.2M (ou Tampon  phosphate 50mM pH 7.5 : dissoudre la caséine dans le tampon, chauffer doucement sous agitation à 80-85°C pendant environ 10 minutes jusqu’à ce qu’une dispersion homogène soit obtenue. Ne pas faire bouillir)

Méthodes :

La manipulation se fait en deux étapes :

Etape 1 : On prépare 4 tubes (la première série) contenants  un mélange réactionnel, on met dans chaque tube :

0.5ml d’extrait enzymatique, 0.75 ml de tampon phosphate, puis dans le tube 1 on ajoute 1.25ml de caséine à 4%, dans le tube 2 on ajoute 1.25ml de caséine à 5%, dans le tube 3 on ajoute 1.25ml de caséine à 6% et dans le 4éme tube on ajoute 1.25ml de caséine à 7%, puis on les incube à 50°C pendant 30 minutes après agitation, ensuite on ajoute 1.25ml de TCA dans chaque tube, et on les laisse pour reposer pendant 10 minute à une température ambiante, enfin on les filtre.

On prépare encore 4 tubes mais cette fois contenant des blancs :

On mais dans chaque tube 0.5ml d’extrait enzymatique, 0.75 de tampon phosphate/citrate, 2.5ml de TCA, et pour le tube 1 on ajoute 1.25ml de caséine à 4%, pour le tube 2 on ajoute 1.25ml de caséine à 5%, pour le tube 3 on ajoute 1.25ml de caséine à 6%, et pour le tube 4 on ajoute 1.25ml de caséine à 7%, puis on les agite et laisse reposer pendant 10 minutes, enfin on les filtre.

Etape 2 :

On prépare 8 tubes dans chaque un on met 0.5 de filtrat à partir d’un des tubes précédents, 1.5ml de solution de , 0.25ml de réactif de Folin, puis on les agite et incube pendant 30 minutes à une température ambiante, finalement on fait une lecture de la DO à  750nm entre le blanc et l’essai pour chaque concentration de caséine tube.[pic 5]

Résultats et discussion :

Les résultats d’absorptions obtenues sont présentés dans le tableau ci-dessous :

A cause des erreurs dans la manipulation on a commis des erreurs dans la mesure de pH = 7 et pH = 9 , où on remarque que les valeurs de Do des blancs est plus élevé que la valeur  de Do des tubes réactionnels , ce qui va nous donner un résultat négative de dosage corrigé . En plus , on est sceptique  sur les deux dernier valeurs où pH = 9 et pH = 11 où non seulement les deux valeurs sont très proche  mais aussi la valeur de la Do corrigée correspondante à pH = 11 est plus grande que celle de pH = 9 ce qui est non intuitive.

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