TP enzymologie

Biochimie : compte rendu TP

Introduction

        La Trypsine est une enzyme digestive produite dans le pancréas. Elle agit au niveau de l’intestin, clive les liaisons peptidiques qui engagent la fonction acide des acides basiques.

Le but est d’effectuer le bilan de purification de la Trypsine et de déterminer les paramètres cinétiques de l’enzyme. Pour cela on effectue trois expériences.

Premièrement un dosage des protéines par la méthode de Lowry, c’est-à-dire une méthode de dosage colorimétrique des protéines. En effet, le réactif réagit avec la liaison peptidique et le réactif de Faulin réagit avec la Trypsine conduisant à la formation d’un complexe coloré dont on mesurera l’absorbance à 710nm.

Ensuite on effectue une mesure de l’activité enzymatique des fractions, qui a pour principe de mesurer l’absorbance en fonction du temps. On fait de même pour déterminer les paramètres cinétiques de l’enzyme en faisant varier la quantité du substrat. On utilise le substrat Arginine couplé à un chromophore, lorsque l’enzyme est clivé à l’Arginine, elle devient incolore.

1. Dosage des protéines par la méthode de Lowry

Le but de cette expérience est de déterminer le nombre de protéine par rapport l’absorbance.

On effectue un dosage d’une gamme de référence de BSA dans 7 tubes à hémolyse et un 8ème  qui est le témoin donc sans BSA. Pour obtenir une solution de protéines à doser, on effectue un triplicata à 2 dilutions différentes, une au 1/50ème et une au 1/100ème pour chacun des échantillons à doser. Il y a 6 tubes avec l’extrait brut et 6 tubes avec la fraction purifiée. Ensuite on rajoute dans tous les tubes (les 20) du réactif C qui est préparé à partir du mélange des 3 solutions A, B1, B2 (le réactif C est sensible aux liaisons peptidiques de la Tyrosine), on mélange au vortex puis on attend 10mins. On ajoute ensuite le réactif de Folin (qui est sensible au noyau phénolique de la Tyrosine), on mélange encore une fois et enfin on patiente 30mins avant de mesurer l’absorbance avec une longueur d’onde de 710nm.

...