Compte Rendue: Enzymologie

I. Introduction.

Le but de l’expérience est d’étudier et de déterminer la cinétique de l’enzyme phosphatase alcaline en fonction de la concentration en substrat et de déterminer son pH optimum (pH pour lequel l’enzyme à la vitesse de catalyse la plus rapide).

II. Principe.

Afin de suivre la réaction enzymatique, réalisation de dosages spectrophotométriques des produits apparus dans le milieu, quand l’enzyme est en présence de son substrat. Pour le dosage, nous allons utiliser comme substrat le P-nitrophénolphosphate (PNPP) qui, après action de l’enzyme, libère un produit coloré (jaune) : le P-nitrophénol (PNP) directement dosable à 410nm.

Le principe du dosage spectrophotométrique est de mesurer l’absorbance d’une substance colorée, au cours du temps. Le spectrophotomètre est relié à un dispositif d’enregistrement (ordinateur), qui nous permet de visualiser l’évolution de l’absorbance dans un intervalle de temps (3min), et donc de déterminer la vitesse initiale de la réaction enzymatique grâce à la pente de la droite obtenue, dans les temps initiaux (ΔDO/min).

Pour déterminer la quantité de produit apparu dans le milieu, on réalise une gamme étalon de tubes contenant différente concentration de produit.

III. Manipulations préliminaires.

Préparation de 6 tubes de solution de PNPP à 2,5mM, 1mM, 0,5mM, 0,25mM, 0,167mM, 0,125mM, à partir de la solution fournie de 5mM en effectuant une dilution en cascade.

Gamme étalon.

Préparation de la gamme étalon puis mesure de la densité optique (DO) de chaque tube à 410nm qui est la longueur d’onde a laquelle absorbe le produit PNP. Enfin traçage de la courbe étalon (cf annexe graphique 1)

DO corrigé = DO – DO du blanc (tube1)

[PNP] = (Vpnp/Vtotal) x [PNP]initiale

Tube [PNP] en µM

1 (0/2) x 0,5 x 10^3 = 0

2 (0,025/2) x 0,5 x 10^3 = 6,25

3 (0,050/2) x 0,5 x 10^3 = 12,5

4 (0,100/2) x 0,5 x 10^3 = 25

5 (0,150/2) x 0,5 x 10^3 = 37,5

6 (0,200/2) x 0,5 x 10^3 = 50

Tableau récapitulatif de la dilution en cascade.

[S] en mM Vs-1 en mL Veau en mL Vs en mL Vs+1 en mL Vf en mL

5 10 10 20 10

2,5 10 15 25 10 10

1 10 10 20 15 10

0,5 10 10 20 10 10

0,25 10 5 15 10 5

0,167 7,5 2,5 10 10 0

0,125 10 0 10 10

Concentration de substrat dans le milieu réactionnel (concentration en substrat en présence de l’enzyme).

Solution 1 :

+1,5mL de tampon Tris-HCL pH 8,3

+0,5mL de ZnCl2 0,6mM

+1mL H2O

+0,5mL de PNPP

1ère dilution : Vpnpp/Vtotal = 1/7

[PNPP]= 1/7 x [PNPP]initial

Solution 2 :

+1,75mL de la solution 1

+0,25mL d’enzyme

2ème dilution: Vsolution1/Vtotal = 7/8

[PNPP]finale = 7/8 x [PNPP] = 1/8 x [PNPP]initial

Tube [PNPP]finale en µM

A 0,125 x 0,125 x 10^3 = 15,75

B 0,125 x 0,167 x 10^3 = 20,88

C 0,125 x 0,25 x 10^3 = 31,25

D 0,125 x 0,5 x 10^3 = 62,50

E 0,125 x 1 x 10^3 = 125,0

F 0,125 x 2,5 x 10^3 =312,4

G 0,125 x 5 x 10^3 = 625,0

V.

...