TP Extraction de la lactalbumine

TP

PURIFICATION DE LA LACTALBUMINE

But du TP :

Le but du TP est de purifier et doser l’α-albumine grâce à une chromatographie d’affinité.

Principe :

        Afin de purifier notre protéine d’intérêt, on va la faire précipiter grâce à son pI (point isoélectrique). Cette étape permet de séparer des protéines contaminantes appelés caséines de notre protéine d’intérêt, par centrifugation après ajout d’HCl dans notre lait pour diminuer son pH à 4,6.

        On réalise ensuite une chromatographie d’affinité sur colonne laquelle nous allons greffer des cations divalents Cu2+ grâce à une solution de CuSO4. Notre protéine d’intérêt va interagir avec les cations greffés à la colonne. On élue dans un premier temps les contaminants protéiques, puis dans un second temps, on ajoute un compétiteur qui va interagir avec la colonne et ainsi "relâcher" notre protéine d’intérêt qui sera élué.

        Grâce à l’acquisition des différentes fractions, nous allons observer leur absorbance qui en fonction de n fractions nous permet de donner une analyse qualitative de notre protéine d’intérêt.

        On réalise ensuite une courbe étalon pour quantifier notre protéine d’intérêt dans le lait. Pour cela, nous allons réaliser un dosage par la méthode de Bradford en utilisant une concentration connue de BSA (albumine), ainsi qu’un réactif (réactif de Bradford : bleu de coomasie dans l’acide phosphorique). Le réactif va réagir en présence de protéines. C’est une quantification colorimétrique (il passe du rouge au bleu en présence de protéines).

Comment peut on améliorer la purification

        Pour améliorer la purification, on peut jouer sur différents critères comme le tampon pour commencer. Il faut vérifier sa solubilité dans l’eau, sa stabilité chimique, sa capacité tampon au pH désiré, ainsi que sa compatibilité avec les applications analytiques et expérimentales, ainsi que la compatibilité avec les autres composants de la solution à purifier.

        Ensuite, nous pouvons éviter de trop manipuler afin d’éviter des erreurs expérimentales, en réduisant le nombre d’étapes.

        De plus, il nous faut bien garder notre extrait protéique à froid (4°C) pour ralentir la vitesse de photolyse (s’il y a eut une contamination par des protéases). De plus le froid favorise l’intégrité structurale de la protéine.

        Enfin, on peut ajouter de la RNase et/ou de la DNase afin de détruire des résidus d’ARN et d’ADN qui peuvent contaminer notre échantillon.

        Pour finir, il faut choisir le bon compétiteur, celui qui a la meilleure affinité pour la phase stationnaire.

Peut-on calculer un rendement, un taux de purification

Rendement [pic 1]

[pic 2]

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Pureté[pic 4]

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Taux de purification[pic 6]

Comment faire pour savoir si des protéines ont été retenus de façon non spécifique sur la colonne IMAC

Pour vérifier que l’albumine a été retenue sur la colonne IMAC, on peut réaliser une chromatographie d’exclusion. En effet, connaissant la taille de notre protéine d’intérêt, nous pouvons en déduire dans quelle fraction nous pourrions l’obtenir en choisissant bien la colonne. Si les fractions précédent ou suivant celles contenant notre protéine d’intérêt possèdent des protéines (détection par spectrométrie), alors nous pouvons en déduire d’autres protéines ont été retenus de façon non spécifique.

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