TP D'enzymologie LDH

COMPTE RENDU N°1, ENZYMOLOGIE :

La lactate déshydrogénase, purification partielle par chromatographie d’affinité

But : Purifier la lactate déshydrogénase.

Nous disposons d’un extrait de tissu bovin fœtal.

Purification partielle sur gel de bleu de Cibacron et mesure de l’activité enzymatique

1ère étape : Vérifier la présence de l’enzyme dans notre tissu.

Réaction d’oxydation du lactate (dans les mitochondries) :

Lactate + NAD + Pyruvate + NADH,H+

Si notre enzyme est présente, la réaction va s’effectuer et la concentration en NADH, H+ va augmenter au cours du temps. Nous mesurons l’absorbance du NADH, H+ à 340 nm.

En effet, l’absorbance est proportionnellement liée à la concentration d’après la loi de Beer lambert :

A = £ . l . c

Si l’absorbance augmente alors la concentration en NADH,H+ augmente .

Cette première étape correspond à notre première mesure, nous mettons en présence le substrat ( Lactate + NAD+) et l’extrait ( LDH supposée présente ).

Le résultat nous montre une croissance de l’absorbance, pente= 0.44

Il y a formation de NADH, H+, la réaction s’effectue, notre enzyme est présente dans notre extrait.

2me étape : chromatographie, lavagede la colonne après passage de l’extrait

Nous faisons passer notre extrait au travers d’une colonne contenant du bleu de Cibacron.

Ce colorant présente des molécules analogues au coenzyme NAD+. Elles vont se fixer à l’enzyme en prenant la place du le ligand qui ne peut alors plus se lier, la réaction ne se réalise pas et les enzymes sont retenus dans la colonne.

Nous vérifions qu’il n’y a pas présence de l’enzyme dans la fraction non retenue (récupération de l’extrait passé à travers la colonne) et dans la fraction de lavage (courbe 2 et 3)

L’absorbance est constante, il n’y a pas présence de l’enzyme pour ces deux fractions.

3ème étape : chromatographie, élution de la colonne

Nous procédons ensuite à l’élution de la colonne pour récupérer les molécules retenues. Nous répétons l’élution 3 fois de suite (courbes, 4,5 et 6).

L’absorbance de la première élution augmente pente : 0,6. Les enzymes LDH sont présentes dans cette fraction.

Pour les deux autres fractions, l’absorbance est constante, il n’y a plus de LDH, elles se sont surement toutes décollées de la colonne lors du passage de la première fraction d’élution.

Electrophorèse :

1ère électrophorèse

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