TP LDH

But du TP :

Au cours de ce TP, nous allons extraire et purifier une enzyme, ici la Lactate Déshydrogénase (LDH) dans le but de calculer l’activité de cette dernière. De plus, nous allons calculer les différentes concentrations en protéines dans chaque extrait et ainsi en déduire l’enrichissement et le rendement de Lactate Déshydrogénase.

Principe :

Nous disposons tout d’abord d’hépatocytes de rat. C’est à partir de cette fraction tissulaire que nous allons pouvoir extraire et purifier notre enzyme d’intérêt, la Lactate Déshydrogénase (LDH).

Pour cela, nous allons réaliser une chromatographie d’affinité ayant une phase stationnaire composée de gel d’agarose et de bleu de Cibacron. L’affinité de ce dernier avec la LDH va permettre de la séparer du reste de l’extrait d’hépatocytes car il ressemble au cofacteur NADH.

Après avoir placé le gel de bleu de Cibacron dans des conditions de pH et de force ionique adéquates, nous allons déposer notre extrait d’hépatocytes puis rincer notre colonne afin d’éliminer les différents composés non retenus,c’est a dire tout ce qui n’a pas interagit avec le gel, normalement nous ne devrions pas avoir de LDH. Nous avons ensuite réaliser un lavage dans le but d’eliminer toust ce qui pourrait se fixer de maniere aspecifique, il ne devrait pas non plus y avoir d’enzymes car la force ionique n’est pas assez forte. Enfin, nous allons éluer notre enzyme pour pouvoir mesurer l’activité enzymatique de la LDH et pouvoir doser les protéines.

Nous allons maintenant quantifier l’activité de la LDH dans nos fractions obtenues précédemment. Pour cela, nous allons réaliser un dosage spectrophotométrique à 340 nm. Cette longueur d’onde correspond à la longueur d’onde où le NADH absorbe.

Nous allons faire une elution par competition. En effet l’enzyme va interagir avec deux composés differents : le gel et le tampon. L’effet de competition induit par les differents composés du tampon présents en excès (Oxamate=homologue du pyruvate et NADH) décale donc la reaction en faveur des composés du tampon. Ainsi l’enzyme sera decroché de la resine. La réaction suivante sera forcée à s’effectuer dans le sens 1 :

L lactate + NAD+           pyruvate + NADH + H+

L’enregistrement sur papier de l’augmentation de l’absorbance en fonction du temps va ainsi nous permettre de déduire l’activité de la LDH.

Ensuite nous allons calculer les différentes concentrations en protéines de nos fractions pour pouvoir en déduire l’enrichissement et le rendement.

Nous allons pour cela utiliser la méthode de Bradford qui consiste à mesurer l’absorbance à 595 nm de chaque fraction après ajout du réactif de Bradford. Ce dernier va se fixer sur les protéines présentes dans la fraction étudiée et la mesure de l’absorbance va ainsi nous permettre de calculer la concentration en protéine dans cette fraction. Nous allons en déduire ainsi l’enrichissement et le rendement.

Mesure de l’activité enzymatique de la LDH par dosage spectrophotométrique.

Nous effectuons une mesure indirecte de l’activité enzymatique par la mesure de la concentration en NADH dans la solution. Grâce à un tampon très concentré en NAD+ nous pouvons orienter la réaction dans l’unique sens Lactate + NAD+ à Pyruvate + NADH,H+.

Nous pouvons ensuite mesurer la concentration en NADH grâce à l’absorbance mesurée à ε=340nm (longueur d’onde optimale pour le l’absorbance du NADH) dans une cuve de 1cm.

Pour chaque extrait à analyser nous remplissons la cuve du spectrophotomètre avec 950µL de tampon et 50µL de la fraction qui nous intéresse. Cette étape doit être réalisée rapidement pour pouvoir observer les premiers instants de la réaction qui nous permettent de déterminer la variation d’absorbance très rapide. Nous pouvons calculer le rapport entre ΔA et Δt (la pente en min-1) pour chaque extrait à partir des tracés obtenus :

Extrait brut :4.46                 Fraction non retenue :0.025           Fraction de rinçage :0        

E1 :1.83                                                E2 :1.22                                                E3 :0.056

Les résultats sont cohérents avec nos attentes : on observe une décroissance de la variation de l’absorbance dans le temps entre l’extrait pur et la fraction E3. Cela veut dire qu’il y a bien une décroissance de la concentration en LDH dans ces extraits. La présence d’une pente non nulle pour la fraction non retenue montre qu’un peu de LDH était resté dans la solution mais cette valeur est très faible. On voit que la fraction de rinçage non contient pas du tout de LDH ce qui montre que notre manipulation sur la colonne d’élution nous a bien permis de purifier l’enzyme.

Ensuite on calcule Vi (vitesse maximale) pour chaque réaction. On peut obtenir cette vitesse de réaction grâce à la formule Vi = ΔC/Δt.

 Or avec la loi de Beer- Lambert A = ε x l x C on obtient : Vi = (ΔA /Δt) x (1/(ε x l)) x 106 x10-3

On ajoute les puissances de 10 à la fin pour obtenir un résultat en µmoles par litres et par minutes à partir de nos données en moles par mL.

Suite à ce calcul on multiplie les Vi par 20 pour obtenir l’activité totale enzymatique pour 1mL au lieu de 50µL.

Nous obtenons les valeurs suivantes (µmoles /minute/mL) :

Extrait brut :14.4                 Fraction non retenue :0.08             Fraction de rinçage :0        

E1 :5.894                                              E2 :3.939                                              E3 :0.18

Comme pour les valeurs de pente les résultats sont cohérents avec non attentes.

Avec ces valeurs nous pouvons calculer le rendement de la quantité (activité) enzymatique dans nos extraits purifiés. Ce rendement est égal au rapport entre l’activité totale de l’extrait purifié sur l’activité totale de l’extrait brut. Nous obtenons :

...