TP LDH

Printemps 2021          

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La lactate déshydrogénase : purification partielle par chromatographie d’affinité

Introduction

La lactate déshydrogénase (LDH) catalyse la réaction :

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L lactate + NAD+ pyruvate + NADH + H+ [pic 2]

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C'est un tétramère constitué de quatre sous-unités de 35 kDa. Chez les mammifères deux types différents de sous-unités existent, le type M (pour « muscle ») et le type H (pour « heart »), ce qui correspond à cinq formes d’isoenzymes tétramériques : M4, M3H, M2H2, MH3 et H4. 

Bien que ces formes hybrides existent dans la plupart des tissus, la sous-unité de type H prédomine dans le muscle cardiaque, tandis que la sous-unité de type M prédomine dans les tissus comme le muscle squelettique ou le foie.

Dans le cas d’infarctus du myocarde, le taux d’isoenzyme H4 dans le sérum augmente de façon dramatique dans les 12 - 24 heures, ce qui permet une confirmation du diagnostic.

Les différentes isoenzymes diffèrent non seulement par leurs constantes cinétiques mais également par leurs pH isoélectriques, le monomère H étant le plus chargé négativement à pH neutre ou alcalin. Cette dernière propriété peut être utilisée pour séparer les isoenzymes de la LDH par électrophorèse non dénaturante en gel de polyacrylamide.  

La purification partielle de la LDH sera effectuée à partir d’un extrait de foie de rat par chromatographie d’affinité sur bleu Cibacron fixé par covalence sur une phase stationnaire poreuse (ici de l’agarose).  

La structure du ligand est la suivante :

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Ce ligand, qui présente une analogie avec les nucléotides, notamment les cofacteurs adényliques, est relativement peu spécifique et permet la purification d’un groupe de protéines et non pas d’une protéine unique. La purification de la LDH ne sera donc que partielle.

Déroulement du TP

1. Etape de purification : mise en colonne et équilibration du gel, dépôt de l’extrait tissulaire, rinçage du gel puis élution de l’enzyme.
2. Dosage de l’activité de la LDH dans l’extrait de départ et dans toutes les fractions recueillies.
3. Dosage des protéines dans l’extrait et dans la fraction purifiée par la méthode de Bradford.

Principes et protocoles

1. Purification partielle sur gel de bleu Cibacron de la LDH contenue dans un extrait tissulaire 

Généralités 

La fraction de départ pour la purification est un extrait préalablement préparé par les enseignants. Il correspond au surnageant obtenu après centrifugation à 12.000 g pendant 20 minutes à 4°C d’un homogénat de foie de rat. Vous disposerez d’un tube Eppendorf contenant cet extrait brut qu’il faudra maintenir dans la glace pour limiter l’activité des protéases endogènes.  

Le gel de bleu Cibacron doit être équilibré avant d’être utilisé, c’est à dire placé dans des conditions de pH et de force ionique adéquates. Après dépôt de l’extrait, un rinçage du gel sera effectué pour parfaire l’élimination des protéines n’ayant pas d’affinité pour le ligand greffé. Enfin, l’élution de la LDH de la colonne sera obtenue par compétition grâce à un tampon contenant du NADH.

Produits, tampons utilisés

• Tampon d’homogénéisation du foie : Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, ß-mercaptoéthanol 1 mM.
• Gel de bleu Cibacron greffé sur de l’agarose, en suspension dans de l’éthanol 20 %. - Tampon d’équilibration et de lavage du gel : Phosphate de sodium 50 mM, pH 7.
• Tampon d’élution : Phosphate de sodium 50 mM, pH 7, contenant du NADH 0,12 mM et de l’oxamate 10 mM.

Mode opératoire 

• Introduire dans une petite colonne environ 750 µL de gel après l’avoir remis en suspension. Il faut à l’arrivée avoir 1 cm (soit environ 0,5 mL) de gel tassé dans la colonne. A partir de ce moment, il ne faut ni remettre en suspension ni laisser sécher le gel.
• Procéder à l’équilibration du gel en faisant passer 4 mL de tampon de lavage.
• Déposer 1 mL de l’extrait tissulaire sur la colonne et recueillir dans un tube à hémolyse ce qui s’en écoule (fraction non retenue).
• Rincer par 4,5 mL de tampon de lavage. Recueillir la fraction de lavage dans un nouveau tube à hémolyse.
• Eluer par 2 X 1 mL de tampon d’élution en collectant les 2 éluats dans des tubes nommés E1 et E2.

Placer tous les tubes dans la glace dès leur obtention.

2. Mesure de l’activité enzymatique de la LDH dans les différentes fractions 

Généralités Pour quantifier l’activité de la protéine d’intérêt, on effectuera un dosage spectrophotométrique de son activité enzymatique dans l’extrait brut de départ puis dans toutes les fractions obtenues au cours de la purification. On forcera la réaction à s’effectuer dans le sens 1 grâce à l’addition d’un mélange de lactate et de NAD+ en excès. Le NADH (contrairement au NAD+) absorbant à 340 nm avec un coefficient d’extinction molaire M340nm = 6,22.103 M-

1.cm-1, en mesurant l’augmentation de l’absorbance à cette longueur d’onde en fonction du temps, on pourra en déduire l’activité de la LDH.

Mode opératoire a - Régler le spectrophotomètre à 340 nm et faire le zéro sur de l’eau distillée dans une micro-cuve.

b - Introduire dans la micro-cuve 950 µL du mélange de substrats fourni (Tampon glycine-NaOH 0,1 M, pH 9, contenant du L–Lactate 0,72 M et du NAD+ 5 mM). c - Faire dérouler le traceur sur environ 1 cm pour vérifier la stabilité de l’absorbance en l’absence d’enzyme. d - Introduire dans la cuve 25 ou 50 µL (suivant les séances) de la fraction à doser. Pour la première cuve, il s’agira de l’extrait brut de départ. e - Agiter énergiquement avec une petite tige et refermer rapidement le couvercle du spectrophotomètre.

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