Séparation De L'alanine Et De L'arginine Sur résine échangeuse D'ions

I But

Le but de ce TP est de séparer l’alanine et l’arginine d’une solution C. On veut aussi calculer les concentrations respectives de chaque espèce et vérifier l’efficacité de la séparation.

II Principe

Pour la séparation, on utilisera la résine échangeuse d’ion contenant de l’amberlite IRC 50. Pour les calculs de concentrations, on montera une courbe d’étalonnage après mesure par spectrophotométrie.

a) la séparation par résine échangeuse d’ions

Cette méthode repose sur le fait qu’un groupement chargé négativement se lie très facilement avec un autre groupe en déficit d’électron (chargé positivement). On fait passer une solution contenant des molécules à charges globales différentes dans une résine (chargée négativement dans notre cas grâce au groupement carboxyle). Dans ce TP, les molécules d’intérêt sont des aminoacides, molécules possédants à pHi un groupe COO- et NH3+. On débute par un pH relativement faible pour que les espèces d’intérêt soit chargées positivement mais pas non plus trop faible car le groupe carboxyle de la résine doit rester déprotoné. A cette étape, tous les acides aminés sont retenus. On augmente au fur et à mesure le pH ambiant pour que les espèces se décrochent une par une. En effet, l’augmentation du pH induit une protonisation des molécules d’intérêt et un décalage progressif vers une forme électriquement neutre. La différence d’élution se faire grâce aux pHi différents selon les acides aminés. On récupère ensuite les solutions d’élution, on peut ainsi séparer les espèces chimiques.

b-la spectrophotométrie

Cette méthode utilise l’absorption d’un rayon lumineux à une longueur d’onde choisie par une solution colorée afin de connaitre sa concentration. On fait passer un rayon photonique à travers une cuve contenant la solution d’intérêt. Plus sa concentration est élevée, plus la solution est colorée et plus l’absorbance est forte. Cette absorbance est calculée par le spectrophotomètre par différence d’intensité entre le rayon émis et le rayon à la sortie de la cuve (log(I0/I)). Pour le cas de l’alanine, il nous faut la colorer car elle est incolore et n’absorbe donc pas la lumière. On utilise un réactif à la ninhydrine. En effet, cette molécule a pour propriété de réagir avec la fonction amine des acides aminés ce qui provoque une coloration pourpre (à chaud).

c-Méthode d’étalonnage pour la spectrophotométrie :

On monte une gamme de tubes contenants la molécule d’intérêt en solution avec des concentrations connues et de plus en plus élevées afin de connaitre leur absorbance. On trace ensuite un graphique de l’absorbance en fonction de la concentration. Cette courbe est linéaire et a comme coefficient directeur le coefficient d’extinction fois la longueur de la cuve (si on utilise une concentration molaire). Cette équation marche jusqu’à une absorbance de 1. On peut enfin mesurer l’absorbance de notre solution, reporter sa valeur sur le graphe et en déduire sa concentration. Cette méthode est relativement précise mais on doit tenir compte de l’absorbance des solvants pour garder sa précision. Il faudra donc éliminer cette absorbance que l’on appelle « à blanc ». On utilise pour cela le tube 1 pour la gamme étalon et le tube 9 pour les tubes ayant pour solvant le tampon à 0.5mol/L à pH 5.5 (tubes 7 et 8).

III Résultats et interprétations

a) formes ioniques des acides aminés et analyse de la chromatographie

Le passage d’une forme électrique à une autre s’effectue par perte/gain d’un proton.

L’alanine: pHi= pKa+pKb/2=6.02

En raison de sa chaine aliphatique non chargée, l’alanine ne possède que 2 pKa. Son pHi est de 6. Lors de la première élution, le pH est de 4.2. L’alanine se trouve donc sous sa forme zwitterionique et un peu sous la forme cationique. La charge étant globalement neutre,

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