Méthodologie Expérimentales

HISTOLOGIE

1.Définition :

Étude des tissus. Un tissu est formé de cellules, ces différents tissus forment les organes. Pour l’analyse de ces tissus on utilise des techniques microscopique. Est également regrouper dans l’histologie, l’étude des cellules.

2.Méthodes en histologie :

1.Préparation des échantillons

Cette étape dépend de l’objectif final et de ce qu’on veux observer.

Les différentes étapes :

Dissection.

Fixation (déshydratation) : permet de figer l’échantillon et préserver sa structure (elle inhibe l’auto-lyse et la putréfaction) et permet également d’immobiliser les antigènes* in situ. Il existe 3 types d’agents fixateurs : les déshydratants/coagulants, les précipitants et les agents de pontage chimique.

Infiltration.

Inclusion : inclure l’échantillon dans une résine (paraffine) pour obtenir un échantillon solide et permettre de créé des coupes fines d’organes.

Coloration.

2.Coloration topographique

Sert à distinguer les territoires tissulaires et cellulaires.

3.Immuno-histochimie

Permet de localiser des anti-gènes particulier dans les cellules des tissus.

4.Hybridation in situ

5.Microscopie électronique

*Anti-gène : toutes molécules qui peut être reconnus par le système immunitaire.

TD BI 413 F-Techniques

Phillopode : Structure d’actine utiliser par la cellule pour scruter l’environnement.

L’actine est organisée en faisceaux grâce à des protéines comme la fascine, alpha-actinine...

On veut comprendre quelles sont les protéines impliqués dans la formation des phillopodes et comprendre leurs fonctions (maintien ou formation des faisceaux).

Expérience 1 : Expression dans des cellules B6F20.

La séquence codante de fascine va être fusionner à des protéines fluorescente de couleurs différentes, par exemple YFP-Fascine : fascine fusionnée à l’YFP (jaune) dérivé de la GFP (40 kDa). On utilise des promoteurs fort pour observé une sur-expression.

Il faut avant tout vérifier que la fusion à fonctionné, identifier le «bruit de fond» en observant en parallèle les cellules non fusionnés, on va également vérifier que les fonctions et la localisation de la protéine observée ne soit pas modifié par la sur-expression. Si une enzyme est fusionné il faut vérifier que l’activité enzymatique soit resté la même.

Les protéines observés sont localiser au niveau de la membrane, la fascine au phillopode, l’alpha-actinine au niveau des fibres de stress et non au phillopode

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