Travaux pratiques d’immunologie expérimentale

Travaux pratiques d’immunologie expérimentale

1. Des études ont montré que le traitement des cellules HL-60 par le PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) induit leur différenciation en cellules de type macrophages. Après une brève description des photos de microscopies à votre disposition, concluez en quelques lignes sur l’efficacité du traitement au cours de notre expérience (2 points).

[pic 1]

L’observation morphologique des cellules HL-60 montre qu’elles se trouvent en suspension dans leur milieu de culture et de forme ronde (A), lorsqu’on ajoute le PMA, les cellules HL-60 se différencient en macrophages et adhèrent au pétri de culture en s’étendant et en formant des pseudopodes (B).

Les cellules HL-60 peuvent se différencier en cellules de type macrophages grâce au phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) via l’activation de diverses voies de signalisation.

1. Chacun des échantillons « contrôle » et « traitées » a été réalisé en duplicat. Après extraction de l’ARN, une lecture de l’absorbance à 260 nm, 280 nm et 230 nm permet d’obtenir les données récapitulées dans l’annexe 1.

1. Calculez la concentration en ARN de vos échantillons (en µg/µL). (1 point) :

On sait que :

1 unité de A260 = 40 µg/ml d’ARN simple brin.

40 µg/ml= 0,04 µg/µL

Donc la concentration en ARN de vos échantillons = A260nm x 40 µg/ml

1. La suite des expériences sera réalisée sur un seul des duplicats de chaque type d’échantillon. Indiquez, par une réponse argumentée, lequel des échantillons C « contrôles » et des échantillons T « traitées » vous conserverez. (1 point)

La mesure du rapport de DO 260/280 permet de contrôler la pureté des échantillons d’ARN obtenus en évaluant la présence de contaminants (solvants organiques, protéines résiduelles) dans la solution d’ARN. On attend un rapport 260/280 environ ou égal à 2,0 dans le cas d’un ARN pur. Un rapport plus faible traduit généralement une contamination en protéines.

Donc on choisit le HL-60 contrôles C1 (ratio A260nm/A280nm = 1,96) et HL-60 traitées T2 (ratio A260nm/A280nm = 2,00) et c’est là qu’on a plus d’ARN (concentrations les plus élevés).

1. Le ratio A260nm/A230nm permet d’évaluer la contamination par des agents chimiques dont l’isothiocyanate de guanidine. Quel risque comporte la présence de ce sel dans vos échantillons d’ARN, pour la suite des expériences ? (2 point)

Le ratio A260 / A230 est un indicateur sensible des contaminants tel que le thiocyanate de guanidine qui absorbent à 230 nm. C’est un agent chaotrope qui perturbe la structure, et dénature, des macromolécules telles que des protéines et des acides nucléiques. Donc, on risque de perdre la stabilité et la structure tridimensionnelle de l’ARN présent dans l’échantillon et provoquer sa dénaturation.

 Ceci pourrait perturber la suite des expériences et interférer avec la synthèse de l’ADNc et le dd-PCR. Et les résultats ne seront plus fiables.

1. Vos échantillons étant sélectionnés, vous réalisez la réverse transcription / transcription inverse de 1 µg d’ARN en ADNc.

1. Calculez le volume de la solution d’ARN à déposer dans le mélange réactionnel de réverse transcription. (1 point)

Le volume de la solution d’ARN à déposer dans le mélange réactionnel de réverse transcription :

Échantillon HL-60 contrôles C1 :  = 1,64 µL[pic 2]

HL-60 traitées T2 : = 2,25 µL[pic 3]

1. Pourquoi utiliser des amorces oligo(dT) lors de la réaction de réverse transcription ? (2 point)

Les amorces l’oligo(dT) sont des séquences constituées d'une succession de désoxythymidines capables de s'hybrider avec l'extrémité poly(A) 3’ de l’ARNm eucaryote.

A partir de cette extrémité la transcriptase réverse synthétise un brin d’ADN complémentaire du messager de départ. Dans ce cas, tous les ARNm sont a priori copiés en ADNc.

1. Le dosage par droplet digital PCR repose sur la technique générale de la polymérisation en chaîne PCR. Avec vos connaissances de Techniques BM, complétez sur le schéma de principe de la PCR (diapositive 27 du power point), les éléments importants de la technique (en bas du schéma), ainsi que le nom des étapes (en bleu) que vous expliquerez en quelques lignes. (2 points)

[pic 4]

Dénaturation de l'ADN par fusion à haute température pour convertir l'ADN bicaténaire en ADN monocaténaire. Cette étape est réalisée à une température comprise entre 93 et 96°C.

Hybridation à l'ADN cible de deux oligonucléotides utilisés comme amorces. Cette hybridation a lieu à une température comprise entre 55 et 65°C.

Extension de la chaine d'ADN par addition de nucléotides à partir des amorces en utilisant l'ADN polymérase (2) comme catalyseur en présence d'ions Mg2+. La température optimale de travail de l'ADN polymérase est de 72°C.

1. Afin de quantifier l’expression des gènes codant pour plusieurs protéines caractéristiques de l’autophagie (Bécline-1, P62, LC3B, GABARAPL1) par droplet digital PCR, il est nécessaire de définir pour chacun d’eux un couple d’amorces spécifiques de sa séquence. Pour ce TP virtuel, nous nous limiterons à l’analyse des gènes BECN1 (Bécline-1) et MAP1LC3B (LC3B).

1. A quoi correspond la zone en vert, appelée « 5’upstream sequence » (séquence en amont) ?

Il s’agit d’un promoteur eucaryote.

1. Pour BECN1, nous souhaitons amplifier une séquence de 120 nucléotides. Proposez un couple d’amorces possible, chacune d’entre elles ayant une taille de 20 nucléotides. Précisez leur position sur la séquence du gène (à l’aide du numéro des nucléotides) (3 points)

La séquence à amplifier de 120 nucléotides :

373 5’ATGGAAGGGTCTAAGACGTCCAACAACAGCACCATGCAGGTGAGCTTCGTGTGCCAGCGCTGCAGCCAGCCCCTGAAACTGGACACGAGTTTCAAGATCCTGGACCGTGTCACCATCCAG 3’ 493

Donc les amorces de 20 nucléotides seront :

5’ ATGGAAGGGTCTAAGACGTC 3’ (373 jusqu’à 393) et 5’ CTGGATGGTGACACGGTCCA 3’ (473 jusqu’à 493)

5’ GGATGGAAGGGTCTAAGACGTC ---------------- TGGACCGTGTCACCATCCAGGAACTCACAG 3’

                                                                        3’ ACCTGGCACAGTGGTAGGTC 5’

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