TP sur l'enzymologie.

ACCOSSANO Julia

ACHOUKHI Mohamed

L3 BHB Groupe 3.1.1

Compte rendu TP d’enzymologie :

Etude du site actif et des propriétés catalytiques de la chymotrypsine 

1. Introduction[pic 1]

La chymotrypsine est une enzyme protéolytique synthétisée par le pancréas et sécrétée par l’intestin grêle sous forme d’un zymogène, le chymotrypsinogène. Il est le précurseur inactif de cette enzyme. Il sera activé par la trypsine, une autre enzyme protéolytique. Le rôle de la trypsine est donc de couper le chymotrypsinogène au niveau de sa liaison peptidique, pour le transformer en chymotrypsine π active.

Le site actif d’une enzyme est composé de deux régions principales, le site de fixation et le site de la catalyse. Ici, la chymotrypsine contient trois acides aminés essentiels, l’histidine en position 57, l’asparagine en position 102 et la sérine en position 195. Son rôle est de cliver les protéines au niveau de leurs liaisons peptidiques après les acides aminés tels que la phénylalanine, le tryptophane ou encore la sérine.

Le but de ce tp, dans un premier temps est de purifier la chymotrypsine obtenue après activation du chymotrypsinogène par la trypsine et analyse de cette activation par électrophorèse. Puis dans un second temps, nous devrons déterminer les paramètres cinétiques de la chymotrypsine vis-à-vis du Bz-Y-pNA (son substrat), ainsi que la nature de son inhibition par l’aprotinine. Enfin, nous allons analyser les interactions du site actif de la chymotrypsine avec la proflavine par des études spectrales en spectrophotométrie.

1. Principes des méthodes utilisées

La chromatographie d’affinité

Le principe de la chromatographie d’affinité sur colonne est de séparer les composants d’un mélange, de purifier les substances. Pour cela, on va séparer un pool de protéines en plusieurs petits pools, dont certains sont enrichis avec la substance d’intérêt, ici la chymotrypsine. A savoir que la colonne est constituée d’un gel de sépharose couplé à un ligand spécifique à une molécule, dans notre tp la trypsine. Ce ligand est la p-aminobenzamidine. Ceci se fait sous plusieurs étapes :

• Etape de fixation : le mélange de molécules contenant le composé à purifier est chargé sur la colonne d’affinité. Seule la molécule présentant une affinité pour la colonne sera retenue, la chymotrypsine.
• Etape de purification : en continuant à traverser la colonne, le tampon va se débarrasser des molécules à éliminer, ici la trypsine.
• Etape d’élution : la chymotrypsine active purifiée est décrochée de la colonne et recueillie dans l’éluat.

La spectrophotométrie

C’est une méthode analytique quantitative utilisée pour mesurer l’absorbance d’une solution à une longueur donnée. Plus la solution est concentrée, plus le spectrophotomètre absorbe la lumière dans les limites de proportionnalités énoncé par la loi de Beer-Lambert.

1. Matériels et méthodes

1. Formation de la chymotrypsine

1. Activation du chymotrypsinogène

1. Préparation du mélange d’activation

Le chymotrypsinogène (20 mg) est mis en présence dans 2 ml de tampon d’activation. On prélève 10 µl de cette solution pour mesurer le dosage de l’activité chymotrypsine à temps 0 d’activation. Par la suite, on ajoute 100 µL de trypsine (rapport trypsine/chymotrypsine = 1% en poids) pour mesurer l’apparition de l’activité chymotrypsine toutes les 5 minutes.

Calcul : rapport trypsine/chymotrypsine = 1% en poids

20 mg chymotrypsine ×  = 0.2 mg de trypsine[pic 2]

Donc         2 mg → 1 ml

        0.2 mg de trypsine → 0.1 ml soit 100 µl de trypsine

Les erreurs peuvent survenir suite aux dosages de la chymotrypsinogène.

1. Test d’activité de la chymotrypsine

Ce test permet de suivre l’activation de la chymotrypsine en fonction du temps, grâce à un spectrophotomètre. Pour cela, on va s’aider d’un substrat synthétique, le Benzoyl-Tyrosine-Paranitroanilide ou Bz-Y-pNA. On va dans un premier temps préparer une cuve témoin contenant du tampon + DMSO pour étalonner l’appareil à 0. Dans un deuxième temps, on réalise 9 cuve de milieu réactionnel contenant du tampon + substrat, dans lesquelles on ajoute 10 µl à chaque cuve à 5 minutes d’intervalle pour mesurer l’activité de la chymotrypsine. Chaque mesure dure 2 minutes, avec toutes les quinze secondes une mesure qui permet de calculer la vitesse de réaction. La réaction d’activation se poursuivra jusqu’à obtention d’une activité de la chymotrypsine constante, c’est-à-dire quand la vitesse de réaction devient stable.

On calcule la vitesse de réaction des mesures obtenues jusqu’à une activité de la chymotrypsine constante au bout de 2 minutes :

Les premières mesures pour l’activation de la chymotrypsine n’étaient pas cohérentes.

Mesure 4 : 0.127/2 = 0.0635 min-1

Mesure 5 : 0.151/2 = 0.0755 min-1

Mesure 6 : 0.142/2 = 0.071 min-1

Mesure 7 : 0.151/2 = 0.755 min-1.

1. Elimination de la trypsine

Après avoir obtenu une activité de la chymotrypsine maximum et constante, on réalise une chromatographie d’affinité. Cette chromatographie est faite grâce à un gel de sépharose préalablement activé au bromure de cyanogène et couplé à un ligand spécifique de la trypsine active : la p-aminobenzamidine.

[pic 3]

La chymotrypsine du mélange, non retenue sur la colonne, sera éluée avec le tampon d’élution de la chymotrypsine. La trypsine retenue sur le support chromatographique sera éluée à l’aide de la solution d’élution de la trypsine afin de régénérer la colonne. Nous déposons ensuite le mélange d’activation sur la colonne et éluons la chymotrypsine avec environ 5mL de tampon d’élution afin de recueillir l’éluât par fraction de 1Ml. Après cela, l’activité de la chymotrypsine sur le substrat est mesurée avec le spectrophotomètre réglé à 280 nm. Les vitesses correspondantes sont calculées grâce aux pentes obtenues et les deux éluat avec les vitesses les plus élevées sont choisies.

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