TP spécificité des actions enzymatiques : les glycosidases

DAMBRUN Manon                                                                     Groupe A2                                                                                                                            

BENITAH Pauline

COMPTE RENDU TP : SPECIFICITE DES ACTIONS ENZYMATIQUES : LES GLYCOSIDASES

1. BUT :

Le but de ce TP est de déterminer la structure d’un diholoside inconnu grâce à l’action enzymatique spécifique des glycosidases suite à une chromatographie sur couche mince. Un test à la liqueur de Fehling sera subséquemment réalisé pour mettre en évidence son éventuel pouvoir réducteur. Enfin, nous effectuerons la vérification d’une micropipette à piston par méthode gravimétrique afin d’attester de ses qualités métrologiques.

1. PRINCIPE :

1. Action des glycosidases

Les glycosidases sont des exo-enzymes hydrolysant les liaisons osidiques et permettant ainsi la libération d’un ou plusieurs oses formant le polyoside. Ce sont des enzymes très spécifiques et qui possèdent différents caractères de sélection : la nature de l’ose, sa série (D ou L), son anomérie (α ou β), sa forme cyclique (pyrane ou furane) ainsi que du type de liaison osidique. Si tous les critères sont remplis, la glycosidase sera capable d’hydrolyser la liaison osidique et donc d’identifier l’ose en question.

1. La chromatographie sur couche mince (CCM)

La CCM est une chromatographie d’adsorption.

La chromatographie sur couche mince est une technique de séparation des molécules, contenant deux phases : une stationnaire polaire (ici une plaque de gel de silice préalablement imprégnée de Na2HPO4) et une mobile (acétone-eau 9 :1). La phase mobile monte par capillarité le long de la phase fixe.

La séparation se fait en fonction de la polarité des molécules : plus la molécule sera polaire, plus elle s’accrochera à la phase fixe, moins elle migrera. En revanche, plus la molécule sera apolaire, moins elle se fixera à la plaque de silice et plus elle sera entrainée par le solvant.

La grandeur caractéristique de la séparation des molécules se résume à leur rapport frontal :

  avec d=distance de migration (cm) et D=distance ligne de dépôt-front de migration (cm). [pic 1]

Plus le rapport frontal sera élevé, plus la molécule aura migré et plus elle sera apolaire.

Afin d’établir quelles molécules constituent le diholoside, il faut comparer les rapports frontaux par rapport à ceux de molécules témoins : ici, plusieurs oses sont déposés pour comparer leur distance de migration avec celle du mélange du diholoside.

1. Test à la liqueur de Fehling :

La liqueur de Fehling est une solution contenant des ions cuivre (Cu2+), ayant une couleur bleue en milieu basique. En présence de substance réductrice et à chaud, la liqueur de Fehling donne un précipité rouge d’oxyde de cuivre Cu2O après oxydation de l’aldéhyde par les ions cuivre :

[pic 2]

La liqueur de Fehling est donc utilisée pour mettre en évidence la présence de sucres réducteurs dans une solution, c’est-à-dire possédant un OH anomérique libre, non-engagé dans une liaison osidique.

1. Méthode gravimétrique :

La vérification par méthode gravimétrique permet de vérifier les qualités métrologiques des micropipettes à piston utilisées en travaux pratiques. En effet, cette méthode permet de déterminer la justesse et la fidélité de l’instrument par pesée d’un volume d’eau délivré par la micropipette et comparaison à son volume nominal, en utilisant différents paramètres (moyenne, écart-type, coefficient de répétabilité, erreur type de la moyenne).

1. RESULTATS :

DIHOLOSIDE (MELANGE B) :

Le pH du tampon est différent selon les tubes pour que les hydrolyses enzymatiques soient faites au pH d’activité optimale des enzymes.

Chromatographie obtenue :

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