TP : specifite des actions enzymatiques : les glycosidases

TP : SPECIFITE DES ACTIONS ENZYMATIQUES :

LES GLYCOSIDASES.

I. But.

L’objectif de ce TP est de déterminer la composition d’un diholoside par l’action des glycosidases et de mettre en évidence son pouvoir réducteur par la liqueur de Fehling.

II. Principe.

1. Hydrolyse enzymatique : Action des glycosidases

L’hydrolyse enzymatique permet de rompre les liaisons osidiques des oligosides et polyosides par l’action d’enzymes spécifiques aux oses engagés dans la liaison osidique. Il y a libération des oses impliqués.

HOH2C CH2OH HOH2C CH2OH

B OH,H Hydrolase + OH,H

Hydrolyse

Les glycosidases sont des hydrolases, elles rompent donc les liaisons osidiques mais de manière très spécifique.

Leur spécificité d’action dépend de plusieurs paramètres concernant l’ose impliqué dans la liaison :

• La nature de l’ose (son nom)

• La série (L ou D)

• La forme cyclique (pyrane ou furane)

• L’anomérie (α ou β) (si l’OH anomérique est impliqué dans la liaison osidique et donc que l’ose est non réducteur (osyl))

On peut donc savoir avec précision la composition d’un polyoside selon l’action ou l’inaction d’une glycosidase sur l’ose qu’elle catalyse. C’est ainsi que l’on pourra déterminer le nom du diholoside à identifier dans ce TP.

2. Chromatographie sur la couche mince

La chromatographie est une méthode de séparation de constituants basée sur les différences d’affinité des substances à l’égard de deux phases, l’une stationnaire et solide(plaque de silice), l’autre mobile liquide, nommée éluant, qui est un solvant organique . Il s’agit alors de déposer sur la phase mobile une petite quantité du mélange à séparer mais aussi des échantillons témoins qui serviront à caractériser la nature des composés contenus dans le mélange par analogie de migration. En effet, mise au contact de la phase stationnaire, la phase mobile migre de bas en haut, par capillarité, entraînant ainsi avec elle les constituants déposés préalablement. C’est le phénomène d’élution, qui permet la séparation des constituants du mélange à analyser.

Chaque constituant migre d’une certaine hauteur, caractéristique de la substance, que l’on appelle rapport frontal (noté Rf) : Rf= d/D avec d : hauteur de la tâche et D : hauteur du front du solvant.

La phase solide étant polaire, plus un composé sera polaire, moins il migrera. Ainsi, plus un composé sera apolaire, plus il migrera. De la même manière, plus l’éluant sera polaire, plus il entraînera avec lui les composés polaires. Il faut donc choisir un éluant en fonction de sa polarité.

Ici on a fait deux migrations pour obtenir une bonne qualité de plaque, de solvant et de migration.

3. Mise en évidence du pouvoir réducteur par la liqueur de Fehling.

La liqueur de Fehling permet de mettre en évidence la présence de sucre réducteur en solution avec un OH anomérique qui n’est pas impliqué dans la liaison osidique. Elle est de coloration bleue due à la présence de Cu2+ et donne un précipité rouge brique dû à a formation de Cu2O à chaud en présence de sucre réducteur. Le mécanisme est simple, Cu2+ oxyde l’aldéhyde pour donner un précipité de couleur rouge brique : oxyde de cuivre Cu2O, selon la réaction suivante:

R-CHO + 2 Cu2+(aq) + HO-(aq) RCOO- + Cu2O(s) + H2O

Dans le cas des oses, on a un pouvoir réducteur seulement si le OH anomérique est libre. Donc si une solution d’oses donne un précipité rouge en présence de liqueur de Fehling c’est que l’OH anomérique d’un ou plusieurs oses en solution n’a pas été substitué ou

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