TP chromatographie d'exclusion et phase directe

AMARGER Floriane

OSTER Chloé

L2 2B2M TDA22

- TP CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION / PHASE DIRECTE    -

Objectif :  

 L’objectif de ce TP était de purifier de manière la plus stratégique possible les différents composés du mélange osidique MOX en testant des paramètres variables de techniques de séparation.

Principe : [pic 1]

Chromatographie d’exclusion :

La chromatographie d'exclusion permet la séparation des composés suivant leurs tailles et de leurs formes en utilisant une phase stationnaire constituée de billes poreuses.

Ces billes sont fabriquées par polymérisation de sucres. Ces polymères forment un réseau plus ou moins serré. En fonction du diamètre des pores ainsi formés les petits composés pourront rentrer dans ces billes ou au contraire, si elles sont trop grosses, seront exclues de ce réseau. Ces molécules trop grosses ne peuvent diffuser qu'à l'extérieur dans le liquide qui les entoure. Elles prendront donc peu de temps pour éluer hors du gel.

Il s’agit d’un équilibre de répartition des molécules entre une phase mobile (eau) et une phase stationnaire (matrice solide, colonne de Biogel P4).

[pic 2]

• Molécules de taille > diamètre des pores se déplacent dans la phase extra-granulaire

(Exclues = 1éres éluées)

• Molécules de taille < diamètre des pores rentrent dans la phase intra granulaire

(Incluses =dernières éluées)

• Molécules de taille comprise dans les limites du diamètre des pores sont partiellement incluses

(Éluées dans l’ordre de taille décroissante)

Un gel donné a un domaine de fractionnement spécifique (exprimé en termes de masse moléculaire) à l'intérieur duquel les protéines vont prendre, pour sortir du gel, un temps proportionnel à leur taille, donc à leur poids. La colonne de Biogel P4 (= polymère d'acrylamide) a des limites de fractionnement de 800 et 4000 Da.  À l'intérieur de cette marge, les molécules peuvent être séparées les unes des autres pour être récupérées dans différentes fractions.

Une fois les composés du mélange MOX séparés, nous avons pu identifier quelles fractions contiennent des sucres en utilisant la chromatographie sur couche mince.

Chromatographie sur couche mince et tests d’identification d’oses :

L’utilisation de la chromatographie sur couche mince permet d’identifier les fractions contenant des oses.

Dans un premier temps, nous avons déposé (x2) sur une plaque recouverte d’un gel de silice les différentes fractions obtenues après séparation.

La révélation par addition d’acide sulfurique permet d'obtenir, après séchage, des tâches colorées aux différents endroits où les fractions ont été déposées. Ces tâches sont des indicateurs de la présence ou non de composés osidiques dans les différentes fractions. Cette étape permet de savoir sur quelles fractions il faudra travailler en chromatographie sur couche mince avec élution pour pouvoir comparer les composés aux témoins et ainsi déterminer la composition du mélange d’intérêt (ici le mélange MOX).

La CCM consiste à placer sur la plaque de silice (ou autre) un dépôt et de la laisser éluer en la trempant dans un solvant ou un mélange de solvant (appelé éluant), l’éluant diffuse le long du support. La tache migre sur la plaque plus ou moins vite selon la nature des interactions qu'elle subit de la part du support et de l'éluant.

[pic 3]

Solvant = mélange d’eau H2O et d’acétonitrile CH₃CN

Ces interactions sont de type électrostatique / liaison hydrogène. Dans le dépôt, sont présents plusieurs composés dont certains sont polaires, d'autres moins, ou apolaires. Si l'éluant choisi est polaire, il fera migrer plus facilement le composé polaire, ayant plus de facilité à l'emmener dans la phase mobile.

Afin de trouver la meilleure combinaison de phase mobile pour séparer les composés de façon plus efficace il a fallu faire varier les concentrations en eau et acétonitrile du solvant.

Dans ce TP, l’eau étant un solvant très polaire, l’élution entrainera plus facilement les composés polaires lorsque le mélange de solvant sera majoritairement composé d’eau. Inversement, les composés apolaires seront mieux entrainés lorsque le mélange de solvant aura une plus forte concentration en acétonitrile qu’en eau. [pic 4]

        Force éluante de l’eau > 0,95[pic 5]

        Force éluante de l’Acétonitrile = 0,65

[pic 6]

[pic 7]

[pic 8]

[pic 9]

Recherche du solvant de migration pour la chromatographie sur couche mince :

Afin d’optimiser la séparation, notre démarche a été de faire varier les gradients de solvant (force éluante) en commençant avec 50% d’eau et 50% d’acétonitrile, puis en augmentant le pourcentage d’acétonitrile (solvant plutôt apolaire) dans le mélange de solvant si les composés osidiques glucose ribose et dextrane T10 ne sont pas bien séparés.

 Nous avons tout d’abord travaillé avec un gradient de 50% d’eau 50% d’acétonitrile ; puis avec des gradients de 30% d’eau 70% d’acétonitrile ; puis 20% d’eau 80% d’acétonitrile. La séparation en 80% - 20% était nettement meilleure qu’en 50% - 50%. Nous avons fini par effectuer une séparation avec 75% d’acétonitrile et 25% d’eau puisqu’ajouter de l’eau, solvant polaire, nous a permis de faire migrer le ribose plus loin. Plus on augmente la distance de migration du ribose plus on va séparer glucose et ribose, on veut donc faire en sorte d’amener le ribose le plus possible vers la ligne de front. [pic 10]

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