TP Génétique : analyser la transmission d’un marqueur polymorphe du génome humain

TP de Génétique II SV41

Ce TP a pour but d’analyser la transmission d’un marqueur polymorphe du génome humain. Ce marqueur est un SNP (Single Nucleotide Polymorphism) : rs2476601. il est analysé chez des individus appartenant à une des grandes familles du CEPH (Centre d’étude du polymorphisme humain, http://www.cephb.fr/).

Ce marqueur est génotypé par la méthode de PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) : une amplification spécifique suivie d’une digestion par une enzyme de restriction unique. Ce qui permettra d’analyser la transmission des deux allèles de chaque marqueur dans la famille étudiée.

Les principales étapes sont :

• amplification par Polymerase Chain Reaction (PCR) de la région du SNP rs2476601
• préparation d’un gel d’agarose
• digestion par une enzyme de restriction de l’amplification du SNP
• dépôt sur gel d’agarose et migration de la digestion des amplifications du SNP
• révélation du gel du SNP

I. Amplification d’un SNP dans une famille du CEPH

I.1. Qu’est-ce qu’un SNP (Single Nucleotide Polymorphism) ?

C’est un marqueur bi-allélique du génome, caractérisé par la substitution d’une base en une autre :

[pic 1]

Figure 1 : mutations par transitions ou transversions (extrait du cm concernant « les mutations par substitution »).

I.2 Famille du Ceph utilisée

Voici la famille 1331du CEPH utilisée au cours de ce TP :

[pic 2]

II Matériel et Méthodes

II.1 Amorces utilisées

La séquence située de part et d’autre du SNP rs2476601 est la suivante :

5’ ACCACAATAAATGATTCAGGTGTCC[A/G]TACAGGAAGTGGAGGGGGGATTTCA 3’

Ce polymorphisme simple base est localisé dans un exon du gène PTPN22 (protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 22), et conduit au changement R620W.

II.2 Amplification par PCR de la région du SNP

Voici les différents réactifs nécessaires à l’amplification du SNP rs2476601 :

* Complétez la colonne « volume »

* Expliquer le calcul réalisé pour le MgCl2.

Cette PCR comprenait un « témoin PCR » : tous les composants de la réaction étaient présents, mais l’ADN était remplacé par de l’eau. Quel est l’intérêt de ce témoin ?

Un « mix-pcr-mère » a été préparé pour l’ensemble des 15 individus analysés, auquel a été ajouté le témoin, et 2 individus « de sécurité » (individus qui n’existent pas, mais qui évitent de mauvaises surprises de prélèvements des volumes au cours des manipulations). L’eau (d’abord), le tampon RedTaq, les dNTP, les 2 oligos (dans n’importe quel ordre), et l’enzyme (en dernier) ont été mélangés dans cet ordre.

Voici les différentes étapes de la PCR utilisée:

1) 94°C pendant 2 min

2) 60°C pendant 1 min

3) 72°C pendant 1 min

4) 94°C pendant 1 min

35 Cycles de 2) à 4)

5) 60°C pendant 1 min

6) 72°C 5 min

7) maintien à 8°C

II.3 Digestion des produits amplifiés

Les produits amplifiés de 251 pb seront ensuite digérés avec l’enzyme de restriction XcmI

5'...CCANNNNN^NNNNTGG...3'

3'...GGTNNNN^NNNNNACC...5'

Pendant 1h à 37°C dans le mélange suivant :

• 10 µl d’ADN amplifié
• 2 µl d’enzyme 5000U/ml
• 2,5µl de tampon 10X
• qsp 25µl d’H2O (qsp = quantité suffisante pour)

* quel est le volume d’eau à ajouter ?

Il existe un seul site de coupure pour l’enzyme dans le fragment amplifié. Le fragment amplifié de 251pb peut être coupé en deux fragments de 190 pb + 61 pb.

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