Microbiologie

LICENCE SCIENCES DE LA VIE

MICROBIOLOGIE GENERALE

Travaux Pratiques

v.12 12/01/2022

Les manipulations qui vous sont proposées consistent à isoler les germes contenus dans trois suspensions inconnues I, II, III contenant des souches différentes, sensées représenter des produits contaminés d'intérêt industriel ou médical.

I - JOUR 1 : ENSEMENCEMENT DES ISOLEMENTS

Cinq milieux sélectifs (Chapman - D.Coccosel - EMB - Drigalski - Cétrimide) et une gélose nutritive utilisés pour ces isolements seront ensemencés selon la méthode des quadrants (Voir annexe "Isolements").

a) Préparation des milieux de culture

Les flacons de gélose déjà fondus sont stockés dans l'étuve à 50°C. Lorsque l'équilibre de température est atteint (surfusion), les milieux peuvent être coulés en boîte de Pétri (voir démonstration). Prendre la précaution de ne pas laisser flacons ou tubes en attente sur la paillasse, ils se solidifieraient rapidement; les remettre à 50°C, si vous ne les utilisez immédiatement.

Préalablement au coulage des milieux, identifier les boites en notant le nom du milieu sur la tranche de la boite (et non sur le couvercle) que vous allez couler (important, certains milieux ont sensiblement la même couleur une fois solidifiés).

Pour le coulage des boîtes, s'assurer d'un maximum de précautions pour éviter les contaminations accidentelles. Laisser la gélose refroidir et se solidifier près de la flamme du bec Bünsen.

b) Ensemencement (voir démonstration)

Avec l'anse, ensemencer par la méthode des quadrants. Veillez, lorsque les géloses sont solidifiées, à annoter correctement les boîtes en indiquant: votre numéro de paillasse (qui remplace ici l’identifciation par votre nom et votre groupe), le nom du milieu (qui doit déjà figurer sur la tranche de la boite), et enfin le numéro du mélange I, II ou III.

c) Incubation

L'incubation se fera à 37°C durant au moins 24h. Les boîtes de Pétri sont placées gélose vers le haut pour éviter la retombée de gouttelettes de condensation sur la surface d'isolement.

II - JOUR 2 : LECTURES - MICROSCOPIE - REPIQUAGES

a) Lecture des isolements

GELOSE NUTRITIVE

Elle permet le développement de la majorité des germes. De ce fait, elle permet de mettre en évidence des espèces non visualisées sur les milieux sélectifs. De plus, cette gélose sert de "standard" pour apprécier la taille des colonies bactériennes après 24h d'incubation à 37°C

Noter les caractères morphologiques des colonies (on peut également mesurer le diamètre des colonies).

CHAPMAN

La présence de NaCl à 75 g/l permet l'isolement du genre Staphylococcus. De plus, la présence de mannitol et de

rouge de phénol décèle la présence de Staphylocoques potentiellement pathogènes qui, seuls, fermenteront cette source de carbone. Le milieu vire au jaune s’il y a acidification.

D.COCCOSEL

L'agent sélectif de ce milieu est l'azide de sodium. Seuls les Streptocoques se développent dans ces conditions et l'esculine ajoutée dans le milieu permet de repérer les Streptocoques du groupe D, encore appelés Entérocoques ou Streptocoques fécaux, qui sont entourés d'un halo noir dû à l’hydrolyse de l’esculine, un sucre dérivé du glucose.

EMB

Seuls les bacilles Gram ( - ) poussent, les autre germes sont inhibés par la présence d'éosine (E) et de bleu de

méthylène (MB). Certaines espèces donnent sur ce milieu des morphologies tout à fait caractéristiques. Ainsi les colonies d'Escherichia coli ont des reflets "vert métallique en dos de scarabée".

DRIGALSKI

Son usage est le même que le milieu EMB : isolement des bactéries Gram( - ) . Ce résultat est obtenu grâce à la présence de cristal violet (un autre colorant). L'éventuelle fermentation du lactose est mise en évidence par le virage au jaune du bleu de bromothymol contenu dans la gélose.

CETRIMIDE

La présence d'un ammonium quaternaire, le cétrimide, permet la culture quasi exclusive de Pseudomonas aeruginosa. L'apparition d'une coloration bleu-verte n'est pas due à la présence d'un indicateur de pH, mais à la production par le micro-organisme de pigments diffusibles.

b) Repiquages et observations microscopiques

Avant de procéder à l'identification, il convient de repiquer les colonies pour avoir à sa disposition une quantité de germes suffisante pour l'identification et pour s'assurer de la pureté des cultures obtenues.

A partir d'un tube de bouillon nutritif stérile, répartir stérilement dans des tubes à dilution à raison de 0,2 ml de milieu par tube. Utiliser une pipette plastique de 2 ml. Travailler dans des conditions d'asepsie rigoureuses.

Pour chaque type de germe repéré sur les milieux d'isolement, prélever à l'aide de l'anse à ensemencer une colonie bien isolée et réaliser une suspension homogène dans le tube à dilution contenant les 0,2 ml de bouillon nutritif.

A partir de cette suspension, réaliser une coloration de Gram (voir annexe microscopie) pour s'assurer d'une part, de la pureté de la suspension, et d'autre part, que la morphologie des bactéries est en accord avec les résultats de l'isolement.

En cas de réponse négative, réaliser une nouvelle suspension. Sinon ensemencer avec l'anse un tube de gélose nutritive par stries transversales puis un tube de bouillon nutritif (voir démonstration).

Etiqueter les tubes et mettre à incuber.

c) Préparation des boites de gélose qui seront utilisées Jour 3

Couler les boites : gélose nutritve (ABgramme), DNase, KING A, KING B (1 boite par personne) (les milieux sont stockés à 50°C, après avoir été portés à ébullition).

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