Le clonage

BIOLOGIE MOLECULAIRE

Les fondamentaux

Propriétés fondamentales de la molécule ADN

. double hélice droite constituée de deux brins d’ADN

. les deux brins d’ADN s’associent par leurs bases selon la règle

A=T   G=-C        - liaison hydrogène

. chaque brin possède une extrémité 5’ phosphate et 3’ hydroxyle

Orientation antiparallèle des deux brins d’ADN

. permet l’appariement des bases et la formation des liaisons H

. chaque brin est constitué d’une séquence de bases différentes

. chaque brin comporte une information différente de l’autre

. les deux brins sont complémentaires → possibilité de réplication

Les séquences ADN et ARN s’écrivent toujours dans le sens 5’ vers 3’

. peuvent s’écrire sous forme simple ou double brin

Clonage moléculaire : Isolement et amplification à l’identique d’une séquence d’intérêt → protéine recombinante.

Clone = séquence d’intérêt à cloner (l’insert) + séquence ADN vectrice (vecteur)

I/ Séquence d’intérêt à cloner (l’insert)

Les types d’inserts

1) Fragment de restriction

. séquence ADN obtenue en utilisant des enzymes de restriction

=> ce sont des endonucléases qui clivent liaison phosphodiester et qui se trouvent à l’intérieur de la chaîne d’acides nucléiques.

Les enzymes de restriction de classe II

Caractéristiques : homodimériques ou homotétramériques (Bg/II et BamHI)

- magnésium comme cofacteur

- reconnaissent une séquence ADN spécifique (site de restriction)

- le site reconnu est de type palindromique

Trois types d’extrémités générées

Notion d’extrémités compatibles (peuvent se religuer)

. deux enzymes de restriction distinctes :

- reconnaissent des sites de restriction différents

-mais génère la même extrémité

La séquence d’intérêt

2) Séquence ADN obtenue par PCR ou RT-PCR

. ADN amplifié par PCR

. ARN reverse transcrit puis amplifié par PCR

. La PCR peut s’effectuer avec :

- un couple d’amorces classiques

-un couple d’amorces à queues flottantes

La technique de PCR : Polymerase Chain Reaction

Le principe : utiliser une ADN polymérase ADN dépendante pour recopier de l’ADN.

Les composants de la réaction PCR

1) Une matrice ADN (simple ou double brin)

2) La Taq Polymérase

3) Une paire d’amorces

4) Des dNTPs

5) H20

6) Tampon avec Mg2+

>>La Taq Polymérase : Propriétés<<

Issue de la bactérie thermophile : Thermus aquaticus

. c’est une ADN polymérase ADN dépendante

. elle ne possède pas d’activité de correction d’erreur

. elle possède une activité polymérase 5’→ 3’

. elle est thermorésistante

>>Les amorces<<

. s’hybrident de part et d’autre de la séquence à amplifier → délimitent séquence qui va être amplifiée

. fournissent un 3’OH à la Taq polymérase

Design des amorces

- les amorces ont une longueur de 18 à 30 nucléotides de long

- elles doivent avoir des Tm comparables (hybridation comparable)

- les amorces commerciales ont une extrémité 5’OH

Il faut éviter des amorces qui :

- sont complémentaires entre elles → dimères d’amorces

- qui présentent des séquences répétées inversées → tiges boucles

Calcul de la température d’hybridation des amorces à la matrice

. nécessite de connaître la séquence des amorces

. on calcule ensuite le Tm des amorces

(pour des amorces <=30 nt on applique la formule suivante)

Tm= 2(A+T)+4(G+C)

. on choisi le Tm de l’amorce qui est le plus faible et on enlève 5°C

Thyb=Tm-5°C

Les amorces à queues flottantes

. rajoutent des séquences en plus aux extrémités du produit PCR

Ex: des sites de restrictions pour un clonage orienté

Au départ les queues flottantes ne sont pas hybridées à la séquence d’intérêt

Obtention d’un produit PCR avec ces nouvelles extrémités après le troisième cycle

Taille(pb) = longueur du fragment amplifié + longueur des queues flottantes

Le tampon de la Taq Polymérase

Composition :

 Son pH est légèrement basique (optimal pour la Taq polymérase)

Cations bivalents (Mg2+) et monovalents (NH4+, K+)

 Neutralisation des charges négatives des phosphates de l’ADN

 Stabilisation des amorces

La PCR se déroule en trois étapes (grâce à un thermocycleur : bloc chauffant programmable)

(le produit PCR à la taille attendue est obtenu à partir du cycle 3)

1) Dénaturation des brins d'ADN à 95°C

2) Hybridation des amorces :

Thyb = Tm – 5°C

Les amorces s’hybrident à la matrice

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