La méthode de la minipréparation

Minipréparation

En biologie moléculaire, une minipréparation ou miniprep est une technique permettant d'extraire une petite quantité (100 ng à 5 μg) d'ADN sous forme de plasmide provenant de bactéries ayant subi une transformation, le plus souvent effectué sur Escherichia coli.

Une application de cette technique pourrait être de transmettre un plasmide à quelques bactéries d'E. coli et de sélectionner dans un deuxième temps uniquement celles qui ont reçu ce plasmide en utilisant un marqueur génétique comme un gène conférant une résistance à un antibiotique.

Les étapes de la miniprep consistent à lyser les cellules par un détergent en milieu alcalin (SDS-NaOH) afin de libérer l'ADN génomique et plasmidique. L'ADN génomique et les protéines sont précipitées par de l'acétate de sodium. Le précipité est séparé par centrifugation, le surnageant contient l'ADN plasmidique. Celui-ci est précipité par de l'éthanol à 95 % et lavé par de l'éthanol à 70 % pour dissoudre les sels et restituer ses propriétés physico-chimiques à l'ADN.

L'ADN est précipité par un volume double d'éthanol ou un volume égal d'Isopropanol après l'ajout de cations qui neutralisent les charges négatives de la molécule.

Sommaire [masquer]

1 Protocole

1.1 Réactifs

1.2 Préalables

1.3 Méthode par lyse alcaline avec phénolisation (pour les souches MC 1061, BJ et JC 5176)

1.4 Méthode par lyse alcaline sans phénol (méthode pour XL1 blue)

2 Voir aussi

Protocole[modifier | modifier le code]

Réactifs[modifier | modifier le code]

TGE : Tris pH 8 25 mM ; Glucose 50 mM ; EDTA 10 mM

Acétate de potassium de lyse alcaline : 60 ml d’acétate de potassium 5 M ; 11,5 ml d’acide acétique glacial ; 28,5 ml d’eau

Solution de lyse (à préparer au moment même) : 3,5 ml d’eau stérile ; 1 ml de NaOH 1M ; 0,5 ml SDS 10 %

Phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/24/1)

Éthanol absolu

Éthanol 70 %

Préalables[modifier | modifier le code]

Inoculer 3 ml de milieu 853 sélectif (avec antibiotique) avec un tip plongé dans une colonie, incuber overnight à 37°C.

Le lendemain, prélever 1 ml de culture, transférer dans un eppendorf, centrifuger pendant 1 min à 13 000 tr/min et aspirer le surnageant.

Méthode par lyse alcaline avec phénolisation (pour les souches MC 1061, BJ et JC 5176)[modifier | modifier le code]

Placer les eppendorfs à 4° sur glace.

Resuspendre le culot dans 100 µl de TGE refroidi, vortexer.

Ajouter 200 µl de solution de lyse NaOH/SDS, mélanger en inversant deux trois

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