Dépolymérisation des microtubules et des microfilaments d'actine provoquée par le nocodazole et la cytochalasine D

La dépolymérisation des microtubules et des microfilaments d’actine provoquée par le nocodazole et la cytochalasine D affecte la forme cellulaire et la morphologie nucléaire des cellules 3T3.

Introduction 

Le but de la manipulation est d’observer des cellules NIH3T3 de fibroblastes murins. Nous

allons nous demander quels sont les effets du traitement au nocodazole et à la cytochalasine

sur le cytosquelette des cellules NIH3T3 ?

Pour cela nous allons réaliser 3 marquages différents:

• un marquage de la tubuline par immunofluorescence indirecte à l’aide d’un anticorps

primaire (de souris) monoclonal qui est est dirigé contre la tubuline alpha et un

anticorps secondaire polyclonal dirigé contre les Ig de souris couplé au FITC

• de l’actine grâce à la phalloïdine qui a une forte affinité naturelle avec l’actine, et qui

est une sonde fluorescente

• des noyaux grâce au DAPI qui est un intercalant de l’ADN.

Pour cette expérience nous allons réaliser 4 lots de cellules:

• un lot qui servira de témoin positif
• un lot qui servira de témoin négatif (lot sans anticorps primaire)
• un lot avec traitement au nocodazole
• un lot avec un traitement à la cytochalasine

Ensuite afin d’observer ces différents marquages nous allons observer ces cellules grâce à un

microscope optique à fluorescence.

Résultats 

1. Organisation du cytosquelette des fibroblastes murins 3T3 en interphase.

1.1 Cellules contrôles 

Légende: [pic 1]

Observation des cellules NIH3T3 par microscopie optique à fluorescence, grossissement x40

Les microfilaments d’actine sont marqués en rouge grâce à la phalloïdine qui a une affinité

naturelle avec l’actine couplée à un fluorochrome : le TRITC. Les noyaux sont marqués en

bleu grâce au DAPI qui est un intercalant de l’ADN. La tubuline est marquée en vert grâce à

une immunofluorescence indirecte, l’anticorps secondaire est couplé à un fluorochrome: le

FITC.

1.2 Cellules traitées à la cytochalasine [pic 2]

Légende:

Observation des cellules NIH3T3 par microscopie optique à fluorescence, grossissement x40.

Les microfilaments d’actine sont marqués en rouge grâce à la phalloïdine qui a une affinité

naturelle avec l’actine couplée à un fluorochrome : le TRITC. Les noyaux sont marqués en

bleu grâce au DAPI qui est un intercalant de l’ADN. La tubuline est marquée en vert grâce à

une immunofluorescence indirecte, l’anticorps secondaire est couplé à un fluorochrome: le

FITC. Incubation des cellules NIH3T3 pendant 45 minutes à 37°C avec la cytochalasine à

9,85μM.

CmiCyto=0,25mg.mL=0,25g.L       Cm=C*M donc C=Cm/M or M=507,62g.mole

Cmf=0,25*1/50= 0,005g.L      CCyto= 0,005/507,62=9,85E-6 mol.L= 9,85μmol.L

1.3 Cellules traitées au nocodazole

Légende: [pic 3]

Observation des cellules NIH3T3 par microscopie optique à fluorescence, grossissement x40

Les microfilaments d’actine sont marqués en rouge grâce à la phalloïdine qui a une affinité

naturelle avec l’actine couplée à un fluorochrome : le TRITC. Les noyaux sont marqués en

bleu grâce au DAPI qui est un intercalant de l’ADN. La tubuline est marquée en vert grâce à

une immunofluorescence indirecte, l’anticorps secondaire est couplé à un fluorochrome: le

FITC. Incubation des cellules NIH3T3 pendant 45 minutes à 37°C avec le Nocodazole à

0,66μM.

CmiNoco = 20μg/mL                 C=Cm/M

CmfNoco=20/100= 0,2μg/mL=0,2E-3g.L            CNoco=0,2E-3/301,32=6,6E-7mol.L=0,66μmol.L

1.4 Morphologie du cytosquelette

a. Descriptions 

• Cellules 3T3 contrôles :

On peut voir que les microfilaments d’actine sont organisés sous forme de fibres de stress

parallèles et de réseau cortical (sous la membrane).

Les microtubules se propagent dans le cytoplasme: du centrosome, qui se trouve au niveau

du noyau, vers la périphérie.

On peut voir sur ces images, une cellule en mitose mais nous n’allons pas la décrire car nous

nous intéressons aux cellules en interphase.

• Cellules 3T3 + cytochalasine D :

Le signal n’est pas fort, nous avons dû exciter la lame trop longtemps, le fluorochrome a

perdu de de l’intensité.

On peut voir que la forme des cellules traitées à la cytochalasine D n’a pas changé mais le

cytoplasme a diminué de volume.

La délimitation des cellules est moins marquée par rapport aux cellules contrôles, il y a donc

moins d’actine corticale. On observe aussi des agrégats d’actine et non plus des filaments.

En ce qui concerne les microtubules, on ne voit pas de différence au niveau de leur

répartition par rapport aux cellules contrôles, cependant, ils semblent moins diffus.

• Cellules 3T3 + nocodazole :

On remarque que les cellules traitées au nocodazole ont une forme différente des cellules

contrôles, elles sont plus arrondies.

Les filaments d’actine semblent désorganisés à première vue. Cependant lorsque l’on

regarde de plus près, on voit qu’il y a toujours l’organisation de l’actine en fibre de stress

parallèles ainsi que l’organisation de l’actine en réseau cortical. Le marquage n’a pas été

bien réalisé mais on peut dire que les filaments d’actine ont globalement la même

organisation que pour les cellules contrôles.

Les microtubules ont perdu leur répartition et semblent plus diffus dans la cellule comparé

aux cellules contrôles. De plus, on ne voit plus de délimitation du centrosome.

b. Interprétations / discussion

Dans le cas où le marquage n’a pas fonctionné: 1-vous discuterez les raisons potentielle pouvant expliquer l'absence de marquage et 2-vous envisagerez les résultats escomptés.

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