Dosage OGM dans les plants de soja

Détection qualitative et quantitative de soja OGM Roundup Ready® par PCR classique et temps réel[pic 1]

Identification de soja OGM par PCR (Réaction de Polymérisation en Chaîne) en temps réel : Aspects théoriques et expérimentaux

Khadidiatou AIDARA et Frédéric LAUGA, Master 1 STAAE – Parcours ARSA

Unité d’enseignement « Production et analyse de biomolécules », laboratoire de biotechnologie de l’Université Paris – Est Créteil (UPEC)

Déposé le 9 décembre 2020

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Introduction

Les biotechnologistes ont modifié artificiellement le génome des plantes (par ajout la modification d’un ou plusieurs gènes) à des fins avantageuses, menant à la formation d’organismes génétiquement modifiés. Des gènes de résistances ont été procurés aux plantes, notamment face aux pesticides.

C’est le cas du soja OGM Roundup Ready® qui a été modifié pour être résistant Roundup Ready. Le composé actif de ce pesticide est le glyphosate : il a pour but d’éliminer les mauvaises herbes autour de la plantation. Les plantations de soja pouvant être affectées par celui-ci, les biotechnologistes ont réalisé des transformations génétiques dans l’optique de rendre les plantations de soja insensibles.

Il en revient ensuite au consommateur de décider d’intégrer ces produits au quotidien, en étant averti de la présence d’OGM. C’est dans cette optique que la législation européenne impose un étiquetage obligatoire lorsque la part d‘OGM est supérieure à 0,9% d'OGM dans les produits frais ou transformés destinés à l'alimentation humaine ou animale. Du matériel spécifique ainsi que des méthodes scientifiques rigoureuses sont nécessaires à la détection d’OGM dans nos aliments. Il faut pouvoir détecter et quantifier le pourcentage d’OGM et réglementer ainsi en conséquence l’aliment en question pour le bien du consommateur.

Dans le cadre de nos expériences, le choix s’est porté sur la réalisation de PCR (Polymerization Chain Reaction) qualitative et quantitative sur des échantillons de farine de soja. La détection qualitative sera réalisée après PCR classique tandis que la quantification se fera par PCR en temps réel ou qPCR. L’objectif de notre étude est de détecter qualitativement la présence (ou non) d’OGM et de pouvoir ensuite quantifier le pourcentage d’OGM présent dans l’échantillon.

L’ADN de farines de soja va être extrait par le biais du kit DNeasy Plant Mini Kit (cat. N°. 69104). Il servira de matrice pour la PCR classique pour détecter la présence ou non d’OGM dans un premier temps.

En cas de présence (ou même d’absence), le pourcentage d’OGM de l’échantillon sera quantifié par PCR à temps réel, car la PCR classique est moins sensible et ne permet pas la quantification des amplicons. La qPCR permettra l’obtention de droites d’amplifications standards par détection de fluorescence émise par les échantillons préparés. La quantité de produit amplifié sera ainsi observable au cours de la PCR et le nombre de copies amplifiées et de copies initiales peuvent être déterminées.

Deux méthodes de quantifications vont être utilisées : la quantification absolue et la quantification relative. Elles consistent toutes deux en la comparaison de nos matrices d’ADN aux quantités d’OGM inconnus avec des échantillons de références de quantité d’OGM connu. La quantification absolue se base sur les droites standards pour calculer les quantités initiales d’ADN endogène (de référence) et OGM tandis que la quantification relative détermine un rapport endogène/OGM par des courbes standards aux échantillons avec des pourcentages connus d’OGM.

Ces deux méthodes sont utilisées pour déterminer le pourcentage en OGM de notre échantillon de farine de soja.

1. Matériel et méthode

1. Extraction de l’ADN

L’extraction d’ADN a été réalisé à partir de 50 mg de matrice (farine sèche). L’extraction d’ADN a été réalisée avec le kit d’extraction “RNeasy Plant Mini Kit” (cat N° 69104) Qiagen contenant les colonnes suivantes : “QIAshredder” et de “DNA easy spin”. Au sein de ce kit des tampons ont été utilisés. L’ordre d’ajout des tampons est le suivant :

• Le tampon AP1, un tampon de lyse cellulaire alcalin dont le rôle est de favoriser la lyse cellulaire et de solubiliser les membranes.
• Une RNAse pour dégrader l’ARN et conserver uniquement l’ADN comme matériel génétique dans les échantillons.
• Le tampon AP2, qui stoppe l’activité de la RNAse et d’AP1. Il va contrebalancer le pH basique par son acidité et rendre ainsi l’échantillon neutre. On qualifie AP2 de solution neutralisante. AP2 va faire précipiter les protéines, les polysaccharides et les lipides membranaires sous l’action du froid après ajout et ainsi concentrer ces éléments dans le fond du tube après centrifugation pour isoler l’ADN dans l’éluat. 
• Le tampon de précipitation nommé AP3 afin de précipiter l’ADN et de faciliter sa fixation sur la colonne “Dneasy spin”.
• Le tampon de lavage AW est ensuite utilisé dans le but de nettoyer l’ADN fixé à la colonne grâce à l’éthanol qu’il contient.
• En dernier, le tampon AE, qui est un tampon d’élution permettant de récupérer l’ADN présent dans la colonne et l’isoler dans l’éluat.

Au cours de cette étape d’extraction de nombreuses centrifugations ont été opérées en utilisant une centrifugeuse de paillasse Eppendorf Mini Spin et une mini centrifugeuse de paillasse Fisher Scientific. Les micropipettes utilisées sont des micropipettes pipetman Gilson (P20, P200,P1000) et Eppendorf(P10). 

Les incubations ont été réalisées au sein d’un bain marie Bioblock Scientific Polystat.

1. Dosage de l’ADN et quantification au Nanodrop

Le dosage de l’ADN est déterminé par spectrophotométrie en utilisant le spectrophotomètre Nanodrop ND1000 / Nanodrop Technologies permettant de travailler sur des micro - volume. Le blanc est réalisé avec de l’eau. 

La concentration d’ADN est obtenue après observation à 260 nm et va permettre de juger de la pureté de l’ADN après comparaison des concentrations moyennes d’ADN. 

On effectue ensuite deux mesures de spectrophotométrie à 230 et 280 nm pour déterminer respectivement les contaminations par les sucres et par les protéines.  Deux rapports (260/280 et 260/230) sont établis par la suite par le spectrophotomètre. Ils vont permettre de juger de la contamination de l’ADN par les protéines et par les polysaccharides : 

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