Compte rendu travaux pratique biochimie métabolique : Enzymologie

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Compte rendu travaux pratique biochimie métabolique : Enzymologie[pic 1]

Introduction

Une enzyme par définition est une protéine qui présente des propriétés de catalyse spécifiques à une réaction chimique du métabolisme de l’être vivant. En effet, l’enzymologie englobe l’étude de l’ensemble des réactions biochimiques garanti par les enzymes. Elles sont donc indispensables pour vivre. Connaître la façon dont une enzyme assure la catalyse renvoie donc à la clarification de son mécanisme qui implique le contact du substrat avec l’enzyme à travers les acides aminés du site actif. D’une manière générale, les protéines enzymatiques sont des catalyseurs qui, en agissant à des faibles concentrations, fond augmenter la vitesse des réactions chimiques, sans en altérer le résultat. Quand la réaction arrive à la fin, la structure de l’enzyme est identique. Le suivi de la catalyse homogène permet de résoudre dans les détails le comportement de l’enzyme et d’évaluer les paramètres cinétiques qui correspondent. Une enzyme est spécifique à une réaction, donc elle catalyse toujours la même altération, qui se déroule sur des corps chimiques initiaux identiques. Lors de nos 4 TP, nous nous intéresserons spécifiquement à l’INVERTASE.  Son action étant spécifique par rapport au substrat saccharose, capable de l’hydrolyser en Glucose + Fructose. Sachant que l’invertase est une enzyme intracellulaire, son extraction nécessite obligatoirement la rupture de la membrane cellulaire.

Rappelons que les sucres réducteurs sont des glucides qui peuvent agir en tant qu’agents réducteurs de par la présence de groupes aldéhyde libres ou cétone libres. Tous les monosaccharides et certains disaccharides sont des sucres réducteurs. Ses sucres réducteurs monosaccharides peuvent être oxydés par des agents oxydants faibles. Dans un milieu aqueux, ils génèrent un ou plusieurs composés contenant un groupe aldéhyde. Il s’agit d’une propriété caractéristique de la réduction des sucres. Le glucose et le fructose sont notamment deux sucres réducteurs, d’où l’intérêt de les utiliser pour nos manipulations. Le saccharose est quant à lui un sucre non réducteur, c’est-à-dire un glucide qui ne peut pas agir comme agents réducteurs à cause de l’absence de groupes aldéhyde libres ou de groupes cétones libres.

Un grand nombre de dosages biologiques s’appuient sur des techniques enzymatiques qui peuvent se présenter comme le dosage d’une molécule utilisé comme un substrat ou par la détermination de l’activité d’un enzyme. Le principe de dosage fournit à l’enzyme présente un substrat qui permet de mesurer la variation de l’absorbance « d’un partenaire de réaction » (produit, substrat), qui absorbe à une certaine longueur d’onde définie, au cours du temps.

Le but de nos différents TP est l’étude de l'activité enzymatique de l’invertase au travers de différentes manipulations. Il s'agit d’extraire la fraction soluble de la levure, de mettre en évidence l'activité invertase dans l'extrait cellulaire et de déterminer les conditions optimales de cette activité enzymatique. Ces expériences illustrent le mode d'action des enzymes en général. Dans le TP 1 nous réaliserons l’extraction ainsi que la gamme étalonnage d’une solution standard de glucose et de fructose pour la méthode à l’acide 3,5 dinitrosalicylique (DNS). Pour le 2ème TP, nous déterminerons la vitesse initiale de la réaction. Puis dans le TP 3, c’est la constante de cinétique Km et Vmax de la réaction enzymatique que nous déterminerons. Enfin pour le 4ème TP, nous verrons l’influence du PH et de la température sur les réactions enzymatiques.

Matériel et méthode

Sécurité et verrerie :

Lors des différentes expériences que nous avons réalisées, nous avons dû manipuler des produits et réactifs différents, dont certains doivent être manipulés avec précaution. Notamment des produits acides, (pour nos TP : le DNS) qui peuvent présenter un risque.

Pour se servir de ces différents produits, il est donc nécessaire de mettre des gants ainsi que des lunettes de protection, et bien entendu une blouse de laboratoire adaptée et fermée. Il est également fortement recommandé de manipuler des produits dangereux sous une hotte, pour ne pas respirer des vapeurs dégagées et être plus protégé derrière la vitre en cas d’éclaboussure. Il faut évidemment aussi être prudent lorsqu’on réalise un mélange entre deux produits, de bien lire l’étiquette pour être sûr d’utiliser le produit voulu.

Le laboratoire doit bien entendu être un lieu rangé, et propre, pour éviter tout risque. Il ne faut pas non plus que les couloirs, les paillasses soient encombrés. Et la verrerie doit être nettoyée avec minutie, pour éviter l’accumulation de poussière chargé en produit toxique. Il est aussi recommandé de se laver régulièrement les mains, et bien entendu ne pas manger ou boire dans le laboratoire.

Bien choisir sa verrerie est très important lorsqu’on réalise des manipulations dans un laboratoire. En effet, le bris de la verrerie dû à la fragilité du matériel, aux chocs mécaniques et thermiques, ou à la pression interne, peut entraîner des blessures par éclats de verre, et l’écoulement de produit dangereux, ou une réaction dangereuse due à une rupture de confinement. Il faut donc privilégier les récipients en plastique, s'ils sont compatibles avec le produit manipulé, et les différentes opérations. Utiliser de la verrerie spéciale résistante aux chocs thermiques, examiner l’état de la verrerie avant chaque utilisation pour repérer toute brèche ou défaut qui la fragiliserait.

Calcul pour le TP1 :

Pour commencer ce premier TP, nous devions d’abord préparer les différentes solutions indispensables à l’expérience qui sont les suivantes : Solution de glucose et fructose, solution de saccharose et tampon acétate. Nous avons dû calculer le grammage de chacune des solutions ainsi que le volume d’eau utilisé. Nous avons choisi de réaliser ces différentes solutions avec le binôme de la paillasse en face de nous (Agathe et Doriane), et avons décidé de prendre un volume d’eau pour chaque solution de 100 mL, afin d’avoir une marge au cas où nous devrions refaire plusieurs fois les manipulations (ce qui a d’ailleurs été le cas à de nombreuses reprises). 

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