Compte rendu des travaux pratiques sur la technique ELISA

Compte rendu des travaux pratiques sur la technique ELISA

[pic 1]

Travaux réalisés sous la supervision de madame Piona DARIAVACH le 29/10/21

Arwa ES-SADEQY - Alexander PIGAREV - Mathias ROSSI - Etudiants en L3 BBB

1. Etape 2 :

Vsolution = 25 µL msoluté = Cm * Vsolution

Etape 4 :

Cn = 1 mg/mL Vm = 1µL

Cf = 1 µg/mL

Pour passer de 1 mg/mL à il faut diluer 1000 fois. Donc nous allons mettre 1µL de surnageant dans 999µL de PBS-lait 2%. (1µg/mL) / (50*103 µg/mL) = 1/50000. Donc il va falloir diluer 20 fois. Donc 10µL dans 190µL de PBS-lait 2%. Pour les suivants cela sera une dilution au ½ comme Vf = 200µL

[pic 2]

Etape 5 :

1000/125=8µL. Nous allons donc mettre 8 µL de surnageant dans 992 µL de PBS-lait 2%. Ensuite, il faudra diluer en cascade au demi, donc 73 µL de PBS-lait 2% et 73µL du tube précédent.[pic 3]

Etape 7 :

2000 µL / 2000 = 1 µL

[pic 4]

1. On calcule la moyenne des blancs (puits B2, C2 et D2) :

(DO(B2) + DO(C2) + DO(D2)) / 3 = (0,265+0,228+0,280)/3 = 0,257667

1. Le tableau illustrant les DOs corrigées (DOs lues - moyenne des blancs) des solutions d’IgG standard et des solutions de l’hybridome de souris :

4.[pic 5]

Chaque concentration d'hybridomes a été réalisée en duplicat ce qui donne lieu à deux densités optiques (DO) pour une concentration en hybridome. C’est pour cela que dans un premier temps, nous calculons la moyenne de deux DO pour une même concentration (A). Les valeurs que nous obtenons après passage au spectrophotomètre sont des DO brute. Il faut donc que nous soustrayons à nos résultats les blancs pour avoir les valeurs de DO sans le bruit de fond. Les valeurs de DO pour nos blancs (B2,C2 et D2) étaient de 0,265 ; 0,228 et 0,280 ce qui nous donne une moyenne de 0,258. Lorsqu’on soustrait nôtre valeur de DO moyenne pour le blanc à nôtre moyenne de DO pour chaque concentration d’hybridome ça donne la ligne B.

5.

[pic 6]

Pour la ligne A, il s’agit du même principe de calcul que pour la question 4. et pour la ligne B, nous avons soustrait la valeur de DO moyenne de nos blancs à la DO de chacun de nos puits contenant des IgG à différentes concentrations.

1. Pour nos puits contenant des hybridomes, nous remarquons qu’il y a un problème de linéarité pour les puits 500X et 1000X. En effet, 500X est censé être supérieur à 1000X ce qui n’est pas le cas. Ne pouvant pas déterminer laquelle de ces deux concentrations d’hybridome est la plus réaliste, nous avons donc décidé d’éliminer les deux pour l’interprétation des résultats.

A partir de la courbe nous pouvons déterminer que :

• Pour une dilution au 1/2000 d’hybridome, nous avons une DO de 0,3515 ce qui nous donne une concentration d’environ 7,2 ng/mL. Comme nous l’avons dilué 2000 fois, on multiplie par 2000 les 7,2 ng/mL ce qui nous fait 14 400 ng/mL d’hybridome dans la solution mère d’après ce puit
• Pour une dilution au 1/4000 d’hybridome, nous avons une DO de 0,160 environ ce qui nous donne une concentration d’environ 3 ng/mL d’hybridome. Comme on a dilué 4000 fois l'échantillon,on multiplie par 4000 les 3 ng/mL ce qui nous fait 12 000 ng/mL d’hybridome dans la solution mère d’après ce puit.

En se fiant à ces deux puits, nous obtenons une moyenne de 13 200 ng/mL d’hybridome dans la solution mère. A noter que plus la dilution est forte, plus il y a de manipulation pour l’obtenir, plus le pourcentage d'erreurs est important. Ces résultats sont dans le même ordre de grandeur donc potentiellement proche de la valeur vraie.

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