Biologie moléculaire 1

TP Biologie Moléculaire 1

BUT :

On cherche à déterminer la carte de restriction de l’ADN plasmidique pUC18-wzc ainsi qu’à isoler et purifier le gène wzc.

PRINCIPE :

La carte de restriction est de l’ADN plasmidique pUC18-wzc est réalisé par électrophorèse sur gel d’agarose après digestion enzymatique de celui-ci par des enzymes de restrictions connues.

La purification et l’isolement du gène wzc se fait en extrayant la bande de gel de l’électrophorèse contenant le gène, en purifiant le gène par centrifugation et chromatographie pour enfin le faire migrer une seconde fois par électrophorèse sur gel d’agarose.

INTERPRÉTATIONS ET RÉSULTATS : [pic 1]

Après avoir effectué la digestion enzymatique et l'électrophorèse sur gel d’agarose de nos solutions d’ADN plasmidique pUC18-zwc , nous avons obtenu des photos du gel révélé aux UV (voir photo 1 en annexe).

Grâce aux marqueur Thermo Fischer SM0192 qui contient des fragments d’ADN de taille connue on peut déterminer la taille des bandes qui ont migré dans notre gel. Le BEG (agent intercalant et responsable de la phosphorescence à l’UV), s’insère dans l’ADN à des intervalles réguliers; c’est pour cela qu’on peut dire que deux bandes avec la même intensité font environ la même taille en paires de base.

Le détail des bandes du marqueur de taille (en paire de bases) ci-contre va nous permettre d’estimer la taille de nos fragments d’ADN obtenus par digestion enzymatique.

Etude des piste 1 à 6 à l’oeil :

La piste 1 contient l’ADN plasmidique sans enzymes de restriction, on observe une seule bande à une grande taille de paires de bases. Pour le moment, on ne peut déterminer si l’ADN est relâché ou surendroulé.

La piste 2 (ADN plasmidique + Sal1) présente également une seule bande à une taille de paires de base un peu plus faible que celle de la piste 1. Ceci nous suggère que Sal1 ne présente qu’un seul site de restriction et que l’ADN de la piste 1 est relâché (s’il était surenroulé, la bande de la piste 1 aurait migré plus bas que la bande de la piste 2).

La piste 3 (ADN plasmidique + Pvu1) comprend 3 bandes: 2 bandes à grande taille de paires de bases et une de petite taille de paires de bases. En sachant qu’il y a un seul site de restriction Sal1, Pvu1 présente 2 sites de restrictions.

La piste 4 ( ADN plasmidique + Sal1 et Pvu1) présente 2 bandes seulement alors qu’elle est censée en comprendre 3. On sait que l’intensité des bandes dépend de la quantité de BEG intercalée dans les fragments d’ADN, on peut donc fortement supposer que le 3eme fragments est trop petit pour être visible vu le peu de BEG qu’il contient.

La piste 5 ( ADN plasmidique + Sal1 et Mlu1) nous montre 3 bandes dont 1 (celle du milieu) est une impureté à ne pas tenir compte. Avec une bande à une grande taille de paires de bases et une bande de petite taille de paires de bases, on peut affirmer que Mlu1 a un seul site de restriction ( l’autre étant celui de Sal1).

La piste 6 ( ADN plasmidique + Pvu1 et Mlu1) comprend 3 bandes dont 1 (la 2eme) est identique à d’autres bandes sur les pistes 3 et 4.

Les pistes 7 et 8 contiennent l’ADN plasmidique (respectivement à 1/10eme et 9/10èmes)  digéré par EcoR1 et BamH1, on observe 2 bandes, la première qui correspond au plasmide et la deuxième au gène zwc.

Ces observations nous permettent de commencer à dresser une carte de restrictions qui est seulement représentative des positions relatives des sites de restrictions, sans aucune précision de la taille des fragments que les enzymes engendrent. En effet, toutes les pistes contenant Pvu1 présentent approximativement les deux mêmes bandes à chaque fois, ce qui suggère que les deux sites de restriction Pvu1 se suivent. Cette information prise en compte et en regardant sur la piste 4, le fragment que l’on sait présent mais pas observable ne peut qu' être celui engendré par Sal1; et s’il est si petit c’est que le site de restriction de Sal1 et l’un de ceux de Pvu1 sont très proches. Enfin les pistes 5 et 6 nous montrent que le site de restriction de Mlu1 est plus proche de celui de Sal1 que de ceux de Pvu1 car la bande 2 de la piste 5 est plus petite en nombre de paires de bases que la bande 2 de la piste 6.

Après avoir fait ces approximations à l'œil, nous allons préciser tout cela en préparant une droite log ( taille du fragment en paires de bases) = f ( distance de migration). Le tableau 1 suivant est un tableau récapitulatif de nos interprétations et de nos valeurs calculées.

Tableau 1: tableau récapitulatif des différents fragments ayant migré dans le gel ainsi que leur taille approximative et plus précise.

...